低次烟叶中茄尼醇的超声波辅助提取与纯化

张旗等

摘要：采用超声波辅助溶剂法对低次烟叶中茄尼醇进行提取并通过硅胶柱层析和重结晶对其进行纯化。由正交试验得出超声波辅助石油醚提取低次烟叶中茄尼醇的最佳工艺条件为温度50 ℃，时间60 min，料液比1∶15（m/V，g∶mL），超声波功率200 W，在此条件下，茄尼醇提取率达到0.66%。茄尼醇粗提物经过皂化反应含量提高了20%，皂化后产物通过硅胶柱层析进行分离，纯度达到81%，产率0.4%。此纯度的茄尼醇继续用乙醇重结晶精制，纯度可达到90%，收率86%。

关键词：茄尼醇；超声波；提取；纯化；低次烟叶

中图分类号：TQ914.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）06-1402-04

Ultrasonic-assisted Solvent Extraction and Purification of Solanesol from Inferior Tobacco Leaf

ZHANG Qi1，2，HUANG Long1，GAO Zhi-nong2，HUANG Ming1，YAO Yuan-jun1

（1. Technology Center， China Tobacco Hubei Industrial Co. Ltd， Wuhan 430040， China；

2. College of chemistry and molecular sciences， Wuhan University， Wuhan 430072， China）

Abstract： The ultrasonic-assisted solvent extraction of solanesol from inferior tobacco leaf and the purification of solanesol by silica gel column chromatography and crystallization was studied. The results of the rhombic experiments showed that the optimal values of parameters for the ultrasonic-assisted petroleum ether extraction of solanesol from inferior tobacco leaf were extraction temperature 50℃， ultrasonic treatment time 60min， material-solvent ratio 1∶15（g∶mL）， ultrasonic power 200W. Under these conditions， the extraction rate of solanesol reached 0.66%. The solanesol content of crude extract increased about 20% by saponification reaction. The saponated solanesol was separated by silica gel column chromatography， with the purity of separated solanesol of 81% and the productivity of 0.4%. The separated solanesol was further purified by recrystallization with ethanol， with the purity of solanesol of 90% and the yield of 86%.

Key words： solanesol； ultrasonic； extraction； purification； inferior tobacco leaf

茄尼醇是一种天然的不饱和四倍半萜烯醇[1]，分子式C45H74O，相对分子质量631，为白色粉末或蜡状固体，熔点33 ℃左右，易溶于正己烷、石油醚、丙酮等有机溶剂而不溶于水，对紫外光呈现非选择性吸收，无旋光性。茄尼醇在化学和药物化学中有着非常重要的作用，是泛醌类药物中间体不可替代的成分，是合成纤维素K2的侧链和辅酶Q10以及合成抗溃疡药物、抗癌药物不可替代的天然原料[2，3]。由于茄尼醇属长链半萜类烯醇类化合物，其人工合成难度很大，目前只能依赖从植物叶中提取，主要是从烟草中提取获得。1956年Rowland等[4]首先在烟草中发现茄尼醇，其含量占烟草干料总质量的0.3%～3.0%。目前茄尼醇在日本、韩国、西欧及北美均有较大的销售市场，在国外现有的提取茄尼醇的技术中，工艺较为成熟的是日本专利技术，但该技术存在原料成本高，生产能耗及三废高等缺点[5]。我国烟草行业每年在种植和加工过程中产生大量的低次烟叶，约占总量的25%，如何从这部分低次烟叶中提取茄尼醇，降低原料成本，从而更好的利用烟草资源，具有重要的意义。

超声波在提取天然产物方面的应用已日益广泛[6]，在中药提取方面已经工业化。超声波用于烟草成分的提取则有望减少溶剂耗量，缩短萃取时间，在较低的温度下就可实现高的提取率。粗品茄尼醇的纯化方法大致有柱层析方法、结晶、分子蒸馏技术以及分配逆流色谱等[7-10]，其中柱层析方法对茄尼醇粗品中性质相似的组分有较高的选择性，能顺利分离其他方法难于分离的组分，在茄尼醇精制过程中具有较大优势，是切实有效的纯化手段。本研究主要探讨利用超声波辅助技术提取低次烟叶中的茄尼醇，并采用硅胶柱层析结合重结晶的方法对其进行分离纯化研究，以期提高烟草资源的利用率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

烟叶碎片由湖北中烟工业有限责任公司提供；无水乙醇、丙酮、石油醚、正己烷、乙酸乙酯均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。茄尼醇标准样品（≥90%）购于Sigma-Aldrich公司，薄层层析硅胶板购于青岛海洋化工厂分厂，柱层析用硅胶（100～200目）购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ-5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；D2010W型电动搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；EYEL4型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；SHB-Ⅲ型循环水真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；FW100型高速粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；DHG-914385-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；DZF-6030B型真空干燥箱（上海精密仪器仪表有限公司）；Sartorius BSA423S型精密电子分析天平（上海常衡电子科技有限公司）；Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）。

1.3 方法

1.3.1 烟草原料预处理 将烟叶碎片在60 ℃下烘3 h，粉碎，过20目筛，置于密封袋中备用。

1.3.2 茄尼醇粗提方法 精确称取预先处理过的样品10 g置于250 mL圆底烧瓶中，加入一定量的提取溶剂，将烧瓶置于带恒温加热的超声波发生装置中，装上搅拌装置及冷凝回流管。打开超声及搅拌装置，在一定温度下超声（40 kHz）搅拌（300 r/min）萃取一定时间后取下烧瓶，抽滤。滤液通过旋转蒸发仪浓缩除去有机溶剂后，剩余物即为烟草茄尼醇粗提物。

1.3.3 茄尼醇粗提物的皂化 称取10 g茄尼醇粗提物于250 mL圆底烧瓶中，加入100 mL 0.2 mol/L NaOH乙醇溶液，在60 ℃下皂化反应2 h，停止反应，旋转蒸发除去乙醇得褐色黏稠物，再向烧瓶中加入70 mL去离子水，加热搅拌并滴加盐酸调节pH 7，用石油醚萃取3次（70 mL×3），合并石油醚层，用去离子水反洗一次，旋转蒸发石油醚萃取液得茄尼醇皂化产物。

1.3.4 茄尼醇含量的测定 采用高效液相色谱法对提取物中茄尼醇的含量进行测定，采用外标法定量。色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流动相为乙腈∶异丙醇（50∶50体积比）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；柱前压：60 bar；紫外检测器检测波长：210 nm；进样量：10 μL。色谱检测样前处理：取适量的茄尼醇待测样溶于色谱纯度的异丙醇中，过0.45 μm滤膜后进样。

1.3.5 茄尼醇薄层层析定性分析（TLC） 用石油醚溶解茄尼醇样品，配置成一定浓度的试液，用毛细管点样于硅胶层析板，然后将层析板置于混合溶剂中进行展开，待展开溶剂前沿达到板五分之四处时取出层析板，待溶剂挥发后置于碘缸中显色。通过比较标准样与测试样中展开点的相对位置对茄尼醇进行定性分析。

1.3.6 茄尼醇的纯化 首先对茄尼醇粗提物进行硅胶柱层析纯化，再进行重结晶精制。柱层析采用干法装柱，称取一定量在110 ℃活化2 h的层析柱硅胶（100～200目），加入玻璃层析柱中，缓慢加入石油醚，然后加压赶尽气泡，注意柱内液面须高于硅胶层，待柱子饱和后，放出适量石油醚，使柱内液面高度与硅胶层等高，关闭柱子出液口。准确称取皂化后茄尼醇粗品，用少量石油醚溶解，然后将样品溶液均匀滴加到硅胶柱上，打开柱子出液口，加入洗脱剂进行洗脱。用10 mL的试管进行定体积收集洗脱液，并通过硅胶TLC法定性分析各个不同时间段收集到的洗脱液中茄尼醇含量，将主要含茄尼醇的部分合并，浓缩，然后加入结晶溶剂，在-15 ℃下结晶，过滤得到的晶体在室温真空干燥（20 ℃），即得精制茄尼醇。

2 结果与分析

2.1 茄尼醇粗提溶剂的筛选

溶剂筛选试验提取条件为温度50 ℃，时间30 min，料液比1∶10（m/V，g∶mL），超声功率200 W。筛选溶剂分别为正己烷，石油醚，丙酮，乙醇，乙酸乙酯，筛选指标为茄尼醇提取率和溶剂价格。

茄尼醇提取率=■×100%。试验结果如表1。从表1可以看出，正己烷和石油醚的提取效果最好，乙醇和乙酸乙酯的提取效果较差，其原因是因为茄尼醇的极性较小，根据相似相溶原理，茄尼醇在低极性的溶剂正己烷和石油醚中溶解度较大，在高极性的乙醇和乙酸乙酯中溶解度较小。因此应选取极性小的正己烷或石油醚作为提取溶剂。而从溶剂成本上考虑，石油醚作为提取溶剂更加合适。

2.2 超声波辅助提取最佳工艺条件的确定

通过预备试验得到低次烟叶中茄尼醇提取率较大时各影响因素水平的大致范围，为确定最佳提取条件，选择提取温度、时间、料液比、超声波功率作为试验因素，设计四因素三水平L9（34）正交试验，以茄尼醇粗提物得率作为考察指标对各因素进行筛选，结果见表2。由表2可知，在考察范围内各因素对茄尼醇提取影响主次顺序为超声波功率、料液比、提取温度、提取时间，最佳提取工艺为温度50 ℃、时间60 min、料液比1∶15、超声波功率200 W。在此条件下进行试验茄尼醇提取率达到0.66%。

2.3 茄尼醇粗提物的皂化结果

有报道表明，茄尼醇以游离态和结合态两种形式存在于烟草中，茄尼醇酯型化合物经碱性乙醇溶液皂化可得到脂肪酸和游离的茄尼醇[11]。本试验茄尼醇粗提物浸膏皂化前后经过高效液相色谱检测发现茄尼醇含量提高了约18%，皂化前提取率为0.66%，皂化后提取率达到0.78%。

2.4 茄尼醇的纯化结果

2.4.1 洗脱剂的确定 流动相对化合物的洗脱是流动相分子与被分离化合物分子竞争吸附到吸附剂（硅胶）表面的过程。硅胶表面显极性，因此强极性的流动相占据吸附表面能力强，洗脱能力也强。而目标化合物茄尼醇为弱极性物质，本身在硅胶表面吸附能力就较弱，为了保证其在吸附剂上有一定的吸附保留时间，应选极性相对较弱的流动相。常用的单一流动相按极性排列如下：石油醚<二氯甲烷<氯仿<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇。分别用这几种单一流动相做TLC试验，发现其展开效果都不理想，因此选择混合流动相，综合考虑分离效果、流动相的安全性以及价格最终确定石油醚-乙酸乙酯混合溶剂体系作为流动相。图1为石油醚∶乙酸乙酯体积比为4∶1的混合展开剂中茄尼醇标准样以及测试样的对比TLC图。左边为标准样品茄尼醇展开点，右边与其等高点即为混合物中茄尼醇的展开点，由TLC图可以看出，在此极性混合展开剂中茄尼醇基本与其他物质分开，可以此展开体系对茄尼醇做定性分析。

2.4.2 洗脱剂配比的确定 为了达到最佳的硅胶柱层析分离效果，分别配制体积分数为5%、10%、15%、20%、25%的乙酸乙酯石油醚溶液作为洗脱剂，对吸附于硅胶柱上茄尼醇粗提物进行洗脱试验，洗脱流速控制在4 mL/min（混合物上样量约2 g）。结果表明，10%的乙酸乙酯石油醚溶液，即石油醚∶乙酸乙酯为9∶1的洗脱剂对茄尼醇的分离效果最好。在此条件下层析分离得到的茄尼醇经高效液相色谱检测知其纯度为81%，产率0.4%。

2.4.3 茄尼醇的精制 通过对几种常见溶剂乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚的筛选试验发现，10倍体积的乙醇在-15 ℃的条件下对层析纯化后的茄尼醇的结晶效果最好，收率达到86%，纯度达到90%以上。图2为标准样、皂化后以及结晶精制后的茄尼醇高效液相色谱图，图中保留时间为8.5 min左右处峰即为茄尼醇峰，由图2可以看出，结晶精制后茄尼醇的纯度已达到标准样纯度。

3 结论

本试验研究了低次烟叶中茄尼醇的超声波辅助提取方法和纯化方法。通过筛选发现以石油醚作为超声波萃取低次烟草中茄尼醇的溶剂最为合适。由正交试验得出超声波辅助提取低次烟叶中茄尼醇的工艺优化条件为温度50 ℃，时间60 min，料液比1∶15，超声波功率200 W，在此条件下，茄尼醇提取率达到0.66%。茄尼醇粗提物经过皂化反应含量提高了约18%，皂化后产物通过硅胶柱层析进行分离，硅胶100～200目，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯为 9∶1，茄尼醇产率0.4%，纯度81%。此纯度的茄尼醇继续用10倍体积的乙醇在-15 ℃的条件下重结晶精制，纯度达到90%，收率86%。

参考文献：

[1] ERICKSON R E，SHUNK C H， TRENNER N R，et al. Coenzyme QXI. The structure of solanesol[J]. J Am Chem Soc，1959，81（18）：4999-5000.

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[3] 王 非，郑 珩，余永柱，等.高纯度茄尼醇的现状与市场前景[J].现代化工，2005，25（8）：63-64，66.

[4] ROWLAND R L，LATIMER P H，GILES J A.Flue-cured Tobacco. I. Isolation of solanesol， an unsaturated alcohol[J]. J Am Chem Soc，1956，78（18）：4680-4683.

[5] 彭靖里，马敏象，吴绍情，等.论烟草废弃物的综合利用技术及其发展前景[J].中国资源综合利用，2001，（8）：18-20.

[6] 董娟娥，马柏林，刘 丽，等.超声波提取杜仲叶中有效成分工艺研究[J].西北林学院学报，2003，18（3）：66-68.

[7] 位 华，宓鹤鸣，柳正良.超临界流体萃取结合柱色谱法从废次烟叶中分离纯化茄尼醇的研究[J].中草药，2005，36（5）：690-692.

[8] 孔宁川，唐自文.一种对烟草浸膏深加工制烟草净油及富集茄尼醇的方法[P].中国专利：CN1400300A，2003-03-05.

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[11] SCHOLTZHAUER W S，SEVERSON R F，CHORTYK O T，et al.Pyrolytic formation of polynuclear aromatic hydrocarbons from petroleum ether extractable constituents of flue-cured tobacco leaf[J]. J Agric Food Chem，1976，24（5）：992-997.

2.4.2 洗脱剂配比的确定 为了达到最佳的硅胶柱层析分离效果，分别配制体积分数为5%、10%、15%、20%、25%的乙酸乙酯石油醚溶液作为洗脱剂，对吸附于硅胶柱上茄尼醇粗提物进行洗脱试验，洗脱流速控制在4 mL/min（混合物上样量约2 g）。结果表明，10%的乙酸乙酯石油醚溶液，即石油醚∶乙酸乙酯为9∶1的洗脱剂对茄尼醇的分离效果最好。在此条件下层析分离得到的茄尼醇经高效液相色谱检测知其纯度为81%，产率0.4%。

2.4.3 茄尼醇的精制 通过对几种常见溶剂乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚的筛选试验发现，10倍体积的乙醇在-15 ℃的条件下对层析纯化后的茄尼醇的结晶效果最好，收率达到86%，纯度达到90%以上。图2为标准样、皂化后以及结晶精制后的茄尼醇高效液相色谱图，图中保留时间为8.5 min左右处峰即为茄尼醇峰，由图2可以看出，结晶精制后茄尼醇的纯度已达到标准样纯度。

3 结论

本试验研究了低次烟叶中茄尼醇的超声波辅助提取方法和纯化方法。通过筛选发现以石油醚作为超声波萃取低次烟草中茄尼醇的溶剂最为合适。由正交试验得出超声波辅助提取低次烟叶中茄尼醇的工艺优化条件为温度50 ℃，时间60 min，料液比1∶15，超声波功率200 W，在此条件下，茄尼醇提取率达到0.66%。茄尼醇粗提物经过皂化反应含量提高了约18%，皂化后产物通过硅胶柱层析进行分离，硅胶100～200目，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯为 9∶1，茄尼醇产率0.4%，纯度81%。此纯度的茄尼醇继续用10倍体积的乙醇在-15 ℃的条件下重结晶精制，纯度达到90%，收率86%。

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2.4.2 洗脱剂配比的确定 为了达到最佳的硅胶柱层析分离效果，分别配制体积分数为5%、10%、15%、20%、25%的乙酸乙酯石油醚溶液作为洗脱剂，对吸附于硅胶柱上茄尼醇粗提物进行洗脱试验，洗脱流速控制在4 mL/min（混合物上样量约2 g）。结果表明，10%的乙酸乙酯石油醚溶液，即石油醚∶乙酸乙酯为9∶1的洗脱剂对茄尼醇的分离效果最好。在此条件下层析分离得到的茄尼醇经高效液相色谱检测知其纯度为81%，产率0.4%。

2.4.3 茄尼醇的精制 通过对几种常见溶剂乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚的筛选试验发现，10倍体积的乙醇在-15 ℃的条件下对层析纯化后的茄尼醇的结晶效果最好，收率达到86%，纯度达到90%以上。图2为标准样、皂化后以及结晶精制后的茄尼醇高效液相色谱图，图中保留时间为8.5 min左右处峰即为茄尼醇峰，由图2可以看出，结晶精制后茄尼醇的纯度已达到标准样纯度。

3 结论

本试验研究了低次烟叶中茄尼醇的超声波辅助提取方法和纯化方法。通过筛选发现以石油醚作为超声波萃取低次烟草中茄尼醇的溶剂最为合适。由正交试验得出超声波辅助提取低次烟叶中茄尼醇的工艺优化条件为温度50 ℃，时间60 min，料液比1∶15，超声波功率200 W，在此条件下，茄尼醇提取率达到0.66%。茄尼醇粗提物经过皂化反应含量提高了约18%，皂化后产物通过硅胶柱层析进行分离，硅胶100～200目，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯为 9∶1，茄尼醇产率0.4%，纯度81%。此纯度的茄尼醇继续用10倍体积的乙醇在-15 ℃的条件下重结晶精制，纯度达到90%，收率86%。

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[11] SCHOLTZHAUER W S，SEVERSON R F，CHORTYK O T，et al.Pyrolytic formation of polynuclear aromatic hydrocarbons from petroleum ether extractable constituents of flue-cured tobacco leaf[J]. J Agric Food Chem，1976，24（5）：992-997.