两种瓜类细菌性果斑病菌快速检测技术的比较及应用

郭玉层，潘俊鹏，哈小菲，方黎，方勇，米娜瓦尔·艾克拜尔

新疆维吾尔自治区农业厅哈密植物检疫工作站，新疆哈密 839000

两种瓜类细菌性果斑病菌快速检测技术的比较及应用

郭玉层，潘俊鹏，哈小菲，方黎，方勇，米娜瓦尔·艾克拜尔

新疆维吾尔自治区农业厅哈密植物检疫工作站，新疆哈密 839000

以瓜类细菌性果斑病菌菌悬液田间和调运检疫抽样检查时采集的病组织为试材，比较免疫凝聚试纸条和瓜类细菌性果斑病菌核酸检测试剂盒检测的灵敏度和适应性。两者各有优缺点，前者具有简便、快速、易操作特点，适用于田间快速检测和诊断；后者灵敏度较高，特异性更好，需要较长时间和仪器辅助，适用于室内检测。

瓜类；细菌性果斑病菌；免疫凝聚试纸条；瓜类细菌性果斑病菌核酸检测试剂盒

瓜类细菌性果斑病是西瓜和甜瓜上最重要的毁灭性种传病害，其病原为嗜酸菌属西瓜种（Acidovoraxavenaesubsp.citrulli,简称A.a.c），属世界性检疫病害，主要危害西瓜、甜瓜果实，产生大量病斑并造成果实腐烂，严重时有的地块甚至100%发病，毁田绝收[1]。目前，使用抗病品种是防治果斑病最根本、最有效的措施，但是迄今并没有发现对果斑病免疫或高抗的品种[2]。虽然化学药剂处理可以减少种子的带菌量,但不能从根本上起到防治细菌性果斑病的作用。因此快速而准确地检测病原物是有效进行病害防治的基础和前提。免疫凝聚试纸条检测是利用抗原—抗体之间特异性结合原理的血清学技术[3]。瓜类细菌性果斑病菌核酸检测试剂盒（恒温扩增-试纸法）将病原体DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在反应中加入西瓜细菌性果斑病菌特异性引物和特异性探针，一次性完成病原体的扩增及杂交过程，然后用一次性核酸检测装置对西瓜细菌性果斑病菌感染进行定性检测。

本文探讨西甜瓜细菌性果斑病菌快速检测技术免疫凝聚试纸条法和瓜类细菌性果斑病菌核酸检测试剂盒（恒温扩增-试纸法）在田间和调运检疫过程中的应用及推广。

1 材料与方法

1.1 供试材料

待检病甜瓜采自哈密市淖毛湖镇8批、大南湖镇2批，在烟墩联合检疫检查站随机抽样检验的样品28批，调自广西、云南的西瓜各2批，调自鄯善县的甜瓜2批，调自吐鲁番的甜瓜1批，调自哈密市淖毛湖镇的甜瓜4批，调自五家渠市的甜瓜4批，调自昌吉的西瓜3批。A.a.c菌株由新疆出入境检验检疫局技术中心提供。

免疫检测试纸条，瓜类细菌性果斑病菌核酸检测试剂盒（恒温扩增-试纸条法）（以下简称核酸检测试剂盒）。

1.2 病组织预处理及菌株的菌悬液配制

挑取供试菌株的单菌落，于KB培养基28℃恒温箱中培养2～3d，用无菌水配制成浓度约1× 108cfu/mL的菌悬液备用[4]。将田间采集和烟墩所抽样品的西甜瓜病组织用酒精棉球进行表面消毒，再用灭菌小刀切下，并分别一分为二，其中一份浸于免疫凝聚试纸条配套的样品浸泡缓冲液袋中进行充分的研磨待测，另一份用灭过菌的研钵分别磨碎，并加入适量核酸检测试剂盒中提供的0.1×TE缓冲液（以能完全浸泡病组织为宜）浸泡备用。

2 检测结果与分析

2.1 免疫凝聚试纸条检测

用商品化A.a.c专化型免疫凝聚试纸条检测将1.2中配制的A.a.c菌悬液和组织浸泡液。打开试纸条包装袋，取出试纸条，插入菌悬液和组织浸泡液中，浸泡深度不超过试纸条规定的示意线；5 min后取出试纸条，用吸水纸吸干并观察。观察阳性对照时，对照线和检测线会在3～5min内出现，表明检测结果为阳性；在观察检测无菌DDH2O和PBS缓冲液做的空白对照(阴性对照)时，免疫凝聚试纸条只出现一条对照线，表明检测结果为阴性；在检测瓜病组织浸泡液时，只出现对照线，没有检测线出现，表明检测结果为阴性；这说明检疫人员采集的瓜样品和抽样检验的瓜样品中无瓜类细菌性果斑病发生。如果没有对照线出现，表明该试纸条检测结果无效。

2.2 瓜类细菌性果斑病菌核酸检测试剂盒检测

将1.2中制备的A.a.c菌悬液和瓜病组织浸泡液按核酸检测试剂盒中操作步骤进行样品处理及DNA的提取，恒温扩增和检测，并在规定时间内判读结果。利用核酸检测试剂盒检测A.a.c菌悬液阳性对照时，质控线和检测线会在10min内出现，表明检测结果为阳性；在检测DDH2O水和缓冲液做的空白对照(阴性对照)中的试剂盒中试纸条只出现一条质控线，表明检测结果为阴性；在检测瓜病组织浸泡液时，只出现质控线，没有检测线出现，表明检测结果为阴性；这说明检疫人员采集的瓜样品和抽样检验的瓜样品中无瓜类细菌性果斑病发生或者瓜类果斑病菌的细菌拷贝数低于试剂盒最低检测限。若检测线强度较弱时，将检测线强度与色卡进行对照：≧L4，为阳性，＜L4为阴性。无红色线条出现为无效，表明核酸试纸条失效或一次性核酸检测装置损坏。

2.3 两种方法检测效果的比较

免疫凝聚试纸条和核酸检测试剂盒检测A.a. c菌悬液和西甜瓜病组织浸泡液各有特色和适应性(表1)。

免疫凝聚试纸条检测是利用抗原-抗体之间特异性结合原理的血清学技术，A.a.c菌株的蛋白质作为抗原与试纸条中的特异性抗体结合，通过显色反应来表示菌悬液或病组织浸泡液的检测结果，因此这种方法的特异性一般，灵敏度较低(106cfu/mL)，但投入成本低，操作简易，在田间地头都可检测，而且所用时间极短，只需5min左右，适合田间快速诊断病害[4]。

核酸检测试剂盒是将病原体DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在反应中加入瓜类细菌性果斑病菌特异性引物和特异性探针，一次性完成病原体的扩增及杂交过程，然后用一次性核酸检测装置对瓜类细菌性果斑病菌感染进行定性检测。因此这种方法的特异性较高，灵敏度较高(103～104cfu/mL)，投入成本也较高，且需少量的试剂和仪器设备才能完成检测，其操作简单易行，单个样品的检测所需时间约2h，适合室内快速检测和相关研究使用。而且其中运用了玻璃化DNA聚合酶保存技术实现了试剂盒的常温运输，密闭的一次性核酸检测装置有效避免了扩增产物气溶胶扩散造成的污染和假阳性。

表1 两种方法检测A.a.c的效果比较

3 小结与讨论

本文将免疫凝聚试纸条和瓜类细菌性果斑病菌核酸检测试剂盒应用于田间快速检测和调运检疫快速检测中，并将两种检测方法作了对比分析。结果表明，免疫凝聚试纸条检测的灵敏度为106cfu/mL，并有简便、快速、易操作等特点，适合于田间病害快速检测和诊断;瓜类细菌性果斑病菌核酸检测试剂盒应的检测灵敏度为103～104cfu/mL，比免疫凝聚试纸条提高了100～1000倍，效率高，特异性更好，但需要时间较长2h，而且需要一定的仪器设备，适用于常规实验室的室内快速检测。

免疫凝聚试纸条和瓜类细菌性果斑病菌核酸检测试剂盒的商业化及其推广应用，为瓜类细菌性果斑病的田间快速检测和病害早期的诊断和预防控制提供了技术条件，具有重要的实际应用价值，尤其是将两项技术结合运用于植物调运检疫的快速检测，首先用免疫凝聚试纸条进行瓜类细菌性果斑病菌的快速检测和初步筛选，检出为阳性后再用瓜类细菌性果斑病菌核酸检测试剂盒进行确定，这样大大提高了西、甜瓜的调运检疫效率和瓜类细菌性果斑病菌的检出率。

[1]周黎，张炳坤，冶海林，等.新疆瓜类细菌性果腐病的发生与病原鉴定[J].蔬菜,2013（3）:64-67.

[2]阎莎莎，王铁霖，赵廷昌.瓜类细菌性果斑病研究进展[J].植物检疫，2011，25（3）:71-76.

[3]闻慧，刘兴洋，李国英,等.甜瓜细菌性果斑病菌检测技术研究进展[J].安徽农业科学,2007,35(20):6182-6185.

[4]冯建军，许勇，李健强,等.免疫凝聚试纸条和TaqMan探针实时荧光PCR检测西瓜细菌性果斑病菌比较研究[J].植物病理学报,2006,36（2）:102-108.

郭玉层（1976年—），新疆阿勒泰人，农艺师，主要从事植物检疫的工作。

2013－12－08