高温高湿及对乳大化豆性分的离影蛋响白*二级结构

孙冰玉，刘琳琳，张 光，石彦国

（哈尔滨商业大学食品工程学院/黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076）

高温高湿及对乳大化豆性分的离影蛋响白*二级结构

孙冰玉，刘琳琳，张 光，石彦国**

（哈尔滨商业大学食品工程学院/黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076）

被广泛应用于食品工业的大豆分离蛋白在贮运过程中，其功能特性可能会发生变化。研究采用不同包装形式（100%氮气铝箔包装、80%氮气：20%二氧化碳铝箔包装、60%氮气：40%二氧化碳铝箔包装、真空铝箔包装、实际工厂包装：白板纸塑/HDPE和PE包装）将大豆分离蛋白（SPI）包装后在高温高湿环境（RH 80%、30℃）条件下贮藏12个月。研究贮藏环境、时间、包装条件对SPI的二级结构及乳化性的影响。通过对酰胺Ⅰ带1600～1700cm-1波段的图谱进行分析发现，PE包装中SPI的β-折叠与对照样相比显著下降（p＜0.05），通过对各包装中SPI功能特性的比较得出包装材质对温湿度的阻隔性：铝箔包装＞工厂包装＞PE。通过相关性分析得出，大豆分离蛋白的乳化性与β-折叠含量呈负相关（-0.675）。

大豆分离蛋白；二级结构；乳化性；储藏

大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）是一种机能特性较强、应用很广泛的蛋白质。大豆分离蛋白除营养价值外，还具有许多重要的功能性质，如起泡性、乳化性、溶解性、胶凝性等，这些特性可有效地改善食品的口感，增加食品的弹性、保水性、吸油性，提高贮存性等[1-2]。SPI以低温变性脱脂大豆粉为原料，经碱提酸沉等工序而制得，组分较为均一，蛋白质纯度要求在90%以上[3]。近年来国内外对大豆分离蛋白组成和结构的研究比较关注，因为蛋白的组成和结构是影响功能特性的一个重要的因素。研究人员采用了X-射线衍射、近（远）紫外、圆二色谱法[4-6]、DSC法[7-8]、荧光光谱分析[9-10]、傅立叶变换红外光谱法[11]、电泳技术等技术手段来研究大豆蛋白的构效关系。然而早期研究人员将改善大豆分离蛋白功能特性的焦点放在大豆育种及制取工艺上，而忽略了贮藏过程中环境等因素对功能特性的影响。关于SPI功能特性在不同贮藏条件（环境条件和包装条件）中产生变化的研究国内外尚少。蛋白质在加工和贮藏过程中，SPI功能性质除受蛋白制备条件和蛋白本身组成结构影响外，同时也受环境因素的影响。然而随着食品行业的发展，现代食品加工对大豆分离蛋白的功能特性要求越来越高，因此，对在不同贮藏条件（环境条件和包装条件）下的SPI功能特性发生变化进行研究，对SPI的贮藏及应用具有现实的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆分离蛋白凝胶型：哈尔滨高科技大豆食品有限责任公司提供（蛋白质含量87.12%，水分5.73%，脂肪0.82%，灰分4.91%，NSI值是68.62%）；铝箔袋，PE拉链封口袋，复合袋（内衬袋材质：LDPE；外包装袋材质：白板纸塑）；氮气、二氧化碳：市售；所用化学试剂均为分析纯。

79-1磁力加热搅拌器：江苏金坛市中大仪器厂；KDN-F自动定氮仪：上海纤检仪器有限公司；DQS-700N呼吸式气调包装机：上海轻葩食品包装机械有限公司；Anke TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 大豆分离蛋白的包装

实际工厂包装：使用哈尔滨高科技大豆食品有限责任公司提供的双层包装袋（外包装袋：白板纸塑，内衬袋：高压低密度聚乙烯（HDPE）进行包装[12-13]。气调包装：选择4种气体混合比例：a.真空；b.100%N2；c.80%N2：20%CO2；d.60%N2：40%CO2。使用DQS-700N呼吸式气调包装机抽真空后将预先混合的不同比例气体充入铝箔包装袋内，最后热封封口。普通包装：使用PE拉链封口袋包装。

1.2.2 大豆分离蛋白的贮藏

经包装的大豆分离蛋白在5种环境条件下贮藏于高温高湿环境（RH为80%，30℃）贮藏时间为5个月，以每30d为一个监测周期。

1.2.3 7S/11S比值测定方法

采用SDS-PAGE方法，加样量20μL，分离胶浓度12.5%，电流25mA。

1.2.4 二级结构的测定方法

（1）图谱采集取待测样品1～2mg，采用溴化钾压片。加入变温ATR中，到指定温度后，平衡5min，以相同温度下的1mL水作为背景，均用红外光谱仪扫描，测定波段为400～4000cm-1，扫描次数为32次，室温20℃。

（2）图谱处理用PeakFit v4.12软件对酰胺Ⅰ带1600～1700cm-1波段的图谱进行分析。先校正基线，然后用Gaussian去卷积。再由二阶导数拟合，多次拟合使残差最小。根据峰面积计算各二级结构的比率。各子峰与二级结构对应关系的指认为：1618～1640cm-1和1670～1690cm-1为β-折叠；1650～1660cm-1为α-螺旋；1640～1650cm-1为无规则卷曲；1660～1700cm-1为β-转角[14]。

1.2.5 乳化性的测定方法

乳化活性（EAI）和乳化稳定性（ESI）采用浊度法测定[15]。

2 结果与分析

2.1 高温高湿环境对SPI二级结构的影响

大豆分离蛋白在贮藏前的红外光谱酰胺Ⅳ带的拟合曲线如图1所示，从图中可以发现大豆分离蛋白在贮藏前结构是以β-折叠为主的，如表1所示，其比例占到了46.36%，1648cm-1的峰被指认为无规则卷曲，所占的比例为22.79%，排在第二位；1660cm-1的峰为α-螺旋，含量为15.5%；所占比例最小的为转角结构，仅为9.29%。Fukushima对7S和11S球蛋白进行了研究[16]，发现2种球蛋白分子内部的主要结构是β-折叠和无规则卷曲结构。由于大豆蛋白的主要成分是7S和11S球蛋白，所以研究的结果与Fukushima的结果基本吻合。

图1 大豆分离蛋白贮藏前酰胺Ⅳ带的拟合曲线

表1 大豆分离蛋白贮藏前酰胺Ⅳ带

结合蛋白质化学性质，当蛋白质二级构象发生变化时，主要是β-折叠结构发生变化，表2为在高温高湿条件下贮藏12月后大豆分离蛋白的二级构象变化数据，同样证实了β-折叠结构变化是蛋白质二级结构变化的主要特征，因此在此后的分析中，以β-折叠结构变化代替大豆分离蛋白二级结构的变化。

表2 高温高湿环境下贮藏12月后大豆分离蛋白酰胺Ⅳ带

图2为高温高湿条件下大豆分离蛋白β-折叠含量变化，由图2结果可以发现随着贮藏时间的延长，不同包装条件下大豆分离蛋白的β-折叠均呈逐渐递减的趋势，在开始的一段时间内，蛋白质二级构象的变化较缓，此后蛋白质二级构象的变化加快，到最后蛋白质二级构象变化再度变缓。

图2 高温高湿条件下大豆分离蛋白β-折叠含量变化

高温高湿贮藏环境对大豆分离蛋白的二级构象影响较大。由于蛋白质二级结构的形成几乎全是由于肽链骨架中的羰基上的氧原子和亚胺基上的氢原子之间的氢键所维系，虽然其他的作用力如配位键、范德华力也有一定作用，但蛋白质二级结构的决定因子是肽链间氢键，所以某一肽段或某些肽段间的氢键越多，所形成的二级结构就越稳定，即二级结构的形成有一种协同的趋势。在大豆分离蛋白二级结构中，β-折叠占主要地位，β-折叠是肽链主链较伸展的一种有规则的构象，相邻平行的肽链之间的-NH和C=O形成氢键。顺向平行的氢键间隔一致但交错倾斜，反向平行的氢键间隔有疏有密，这就决定了在高温高湿环境下，水分含量较高，温度较高，热反应加大，水分子容易介入肽链之间，使得R侧基相互反应增多，破坏原有的氢键，而使β-折叠含量减小，蛋白质二级构象改变。

2.2 高温高湿环境对SPI乳化性的影响

由图3和4可知，在高温高湿环境下贮藏时，6种包装中SPI的乳化性随贮藏时间延长而下降。在贮藏初期，充气包装中SPI的乳化性增加，且氮气比例越小，EAI值越大，可能是氮气破坏了氢键等次级键作用，使原先包含在分子内部的疏水基团暴露出来，增加了SPI的亲油性，从而表现为乳化能力增加。在非充气包装中，以真空包装中SPI的乳化性下降幅度最缓慢，原因可能是真空铝箔包装的隔热阻湿性能较好，降低了温度和湿度对SPI的影响，延缓其变性速度，使其在短期内能够保持相对较好的乳化性；而PE包装中SPI的乳化性下降速度最快。6种包装中SPI的乳化稳定性总体上呈现下降的趋势，其中以60%N2：40%CO2充气铝箔包装中SPI的乳化稳定性最相对保持较好，且在贮藏1月后ESI出现最高值，但随贮藏时间的延长迅速下降，可能是适量的氮气有利于蛋白质在水油界面的扩散，降低了水油界面的张力，从而提高了SPI的乳化稳定性，随贮藏时间的延长，蛋白质发生了聚合作用，使SPI的乳化稳定性下降。

图3 RH=80%，T=30℃条件下SPI乳化性变化

图4 RH=80%，T=30℃条件下SPI的乳化稳定性变化

2.3 高温高湿环境下SPI乳化性与二级结构相关性分析

通过大豆分离蛋白在贮藏过程中乳化性及其β-折叠含量的监测，获得其相关变化趋势图，由图5及其相关性分析可知，大豆分离蛋白的乳化性与β-折叠含量呈负相关（-0.675）。β-折叠是蛋白质分子二级结构中主要存在形式，含量越大表明肽链排列越有规律，越为紧密，疏水性基团会集聚在一起，形成疏水区域，与油脂之间的作用减弱，从而降低了乳化能力。

图5 SPI乳化性与β-折叠含量变化

3 结论

在高温高湿贮藏环境（RH 80%、30℃）下，针对不同包装（100%氮气铝箔包装、80%氮气：20%二氧化碳铝箔包装、60%氮气：40%二氧化碳铝箔包装、真空铝箔包装、实际工厂包装：白板纸塑/HDPE和PE包装）的SPI的二级结构及乳化性的分析得知，不同包装条件大豆分离蛋白的β-折叠均呈逐渐递减的趋势，其中以PE包装的下降较为显著，大豆分离蛋白的乳化性与β-折叠含量呈负相关（-0.675）。K.C.Chang等人研究了贮藏条件对大豆中提纯的大豆球蛋白的结构特性的影响[17]，研究发现在不利条件（RH 84%，30℃）下贮藏3月后的大豆中提纯的大豆球蛋白与糖含量有明显关联并且表现为疏水作用下降，二级结构中的α-螺旋的含量略微增加，但是β-折叠含量下降，与研究结果基本相同。贮藏条件对SPI乳化性产生影响的机理有待于进一步深入研究。

［1］李里特.大豆加工与利用[M].北京：化学工业出版社,2003：75-78.

［2］李玉珍,肖怀秋,兰立新.大豆分离蛋白功能特性及其在食品工业中的应用[J].中国食品添加剂,2008(1)：121-124,109.

［3］石彦国.大豆制品工艺学[M].北京：中国轻工业出版社,2005：87-90.

［4］BourassaP,N'soukpoe-KossiCN,Tajmir-RiahiHA.Binding of vitamin A with milk alpha-and beta-caseins[J].Food Chemistry,2013,138(1)：444-453.

［5］M I Sadowski,D T Jones.The sequence structure relationship and protein function prediction[J].Current Opinion in Structural Biology,2009,19(3)：357-362.

［6］Kubelka,Jan.Multivariate analysis of spectral data with frequency shifts：application to temperature dependent infrared spectra of peptides and proteins[J].Analytical Chemistry,2013,85(20)：9588-9595.

［7］Cosmin M.Beliciu,Carmen I.Moraru.The effect of protein concentration and heat treatment temperature on micellar casein-soy protein mixtures[J].Food Hydrocolloids,2011,25(6)：1448-1460.

［8］Wang Xinge,Luo Zhigang,Xiao Zhigang.Preparation,characterization,and thermal stability of-cyclodextrin/soybean lecithin inclusion complex[J].Carbohydrate Polymers,2014,101(1)：1027-1032.

［9］Nobuyuki Maruyama,Mohamad Ramlan Mohamed Salleh,Koji Takahashi,et al.structure-physicochemical function relationships of soybean β-conglycinin constituent subunits[J].Agric.Food Chem,1999,47：5278-5284.

［10］Yin Chunming,Zhou Ruibao.Study on structure-emulsifying properties relationship of Yu-25 soybean 11S Glycinin[M].China&International Soybean Conference&Exhibition,2002：156.

［11］吴玉清,尾崎幸洋.二维相关红外光谱研究溶液中蛋白质的结构[J].红外与毫米波学报,2003(3)：161-168.

［12］黄俊彦,韩春阳,姜浩.气调保鲜包装技术的应用[J].包装工程,2007,28(1)：44-48.

［13］高愿军,熊卫东.食品包装[M].北京：化学工业出版社,2005：89-90.

［14］邢本刚,梁宏.FT-IR在蛋白质二级结构研究中的应用进展[J].广西师范大学学报(自然科学版),1997,15(3)：46-50.

［15］郭兴凤,慕运动,阮诗丰.不同测定方法对大豆分离蛋白乳化性测定结果的影响[J].食品研究与开发,2007,28(2)：129-131.

［16］Fukushima D.Internal structure of 7S and 11S globulinmolecules in soybean proteins[J].Cereal Chem,1968,45(3)：203-224.

［17］Dick Home-jer Hou,Sam Kow-Ching Chang.Structural characteristics of purified glycinin from soybeans stored under various conditions[J].Agric.Food Chem,2004,52(12)：3792-3800.

Effect of High Temperature and Humidity on the Secondary Structure and Emulsibility of Soybean Protein Isolate

Sun Bingyu,Liu Linlin,Zhang Guang,Shi Yanguo
（Key Laboratory of Food Science and Engineering of Heilongjiang,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,Heilongjiang,China）

The SPI was applied in food industry widely,but its functionalities may change during storage.The effect of store temperature,time,RH and package material on emulsibility and the secondary structure of SPI were studied,when SPI was packaged in 100%N2and Al,80%N2：20%CO2and Al,60%N2：40%CO2and Al,vacuum and Al,white paper/plastic/HDPE and PE and then stored for 12 months in the conditions of RH 80%and 30 ℃.It was shown that the β-sheets of SPI only packaged in PE decreased significantly(p＜0.05)observed by 1 600～1 700 cm-1band of AmideⅠmaps.Comparing the functionalities of SPI with different packaging material,it was shown that the sequence of the barrier property of material to T and RH was Al packaging＞factory packaging＞PE packaging.Analyzed by relatedness,it was shown that the βsheets of SPI was negative(-0.675)correlation with emulsibility.

Soy protein isolate(SPI);The secondary structure;Emulsibility;Storage

TS201.2+1

B

1674-3547(2014)04-0026-06

2014-08-07

孙冰玉，女，博士，副教授，研究方向为大豆化学与技术加工，E-mail:sby0451@163.com

2012年黑龙江省研究生创新科研项目（YJSCX2012-128HLJ），2013年哈尔滨商业大学博士科研启动项目（13DL016）

**通讯作者：石彦国，教授，研究方向为大豆蛋白加工技术研究，E-mail:yanguosh@163.com