猪脾转移因子的制备与生物学特性研究

宁豫昌，乔宏兴，马辉

摘要：试验采用透析法提取了猪脾转移因子（TF），并对其理化特性、生物安全性以及其对非特异性和特异性免疫的影响等方面进行了初步研究。结果表明，利用透析法制备的猪脾TF能够显著（P<0.05）增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力；对于E玫瑰花环的形成数和形成率具有极显著（P<0.01）的促进作用；将猪脾TF与猪瘟疫苗同时使用，能够显著（P<0.05）提高机体体液免疫的抗体滴度。此外，制备的猪脾TF安全无毒、无抗原性，不会使异种动物体内产生相应抗体。表明猪脾TF对于机体的特异性和非特异性免疫均有促进作用，是一种安全的生物免疫调节剂。

关键词：猪脾转移因子（TF）；理化特性；生物安全性

中图分类号：S852.4；S859.79+7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1612-04

Preparation of Transfer Factor of Porcine Spleen and Its Biological Characteristics

NING Yu-chang，QIAO Hong-xing，MA Hui

（Henan University of Animal Husbandry and Economy， Zhengzhou 450011， China）

Abstract：The transfer factors（TFs） of porcine spleen were extracted by dialysis method and studied on the physical and chemical properties， biological security， and its effects on non-specific and specific immune. The results showed that TFs significantly enhanced the mouses peritoneal macrophage phagocytosis （P<0.05），and extremely increased the E rosette formation number and rate（P<0.01）. Used with classical swine fever vaccine， the antibody titer of humoral immunity prominently increased（P<0.05）. In addition，the extracted TFs was safe and non-antigenic. The disparate animals had no antibodies produced. It is indicated that TFs of porcine spleen could promote the body's non-specific and specific immune， and was a safe biological immunomodulators. With the further research of TFs，the application of it in controlling animal disease will be more extensive.

Key words： transfer factor（TF）； physical and chemical property； biological safety

转移因子（Transfer factor，TF）自1949年被发现以来[1]，已被人们广泛研究。TF是存在于人和动物白细胞中的可透析小分子物质，能将供体所具有的细胞免疫功能转移给受体，从而非特异性地增强受体的免疫功能[2]。此外，TF还可以通过T细胞来调节B细胞，缩短机体的免疫应答期，产生较高滴度的抗体[3-5]。TF的成分主要包括低聚核苷酸和多肽，相对分子质量约为3 500～5 000，安全无毒，无抗原性，且无种属差异，是一种新型而又安全的免疫制剂[6]。国内外已将TF用于人医临床治疗，并取得一定的效果。目前也有将TF用于临床兽医的研究和应用方面的报道，如将TF用于鸡、猪、牛等动物疫病控制及免疫调节方面[7-9]。总之，TF在兽医领域具有重要的应用价值和广阔前景。河南是全国养猪大省，每年伴随生猪屠宰产生了数量极大的废弃物，为了变废为宝，将屠宰废弃物转变为价值较高的生物制品，减少生猪屠宰所造成的环境污染，本试验对猪脾TF的制备方法、理化性质、生物学特性以及其对非特异性和特异性免疫的影响等方面进行了研究，以期为TF能够普遍应用于兽医临床提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

猪脾脏：取新鲜、外观红润、有光泽的猪脾脏（郑州肉联厂提供），去除表面脂肪和筋膜；试剂：1%鸡红细胞悬液、绵羊肝素抗凝血（绵羊颈静脉采血后以10 IU/mL的比例加入肝素钠）、小牛血清、20%磺基水杨酸、Folin-酚试剂、标准D-核糖、三氯醋酸、二羟基甲苯、无水三氯化铁、盐酸、可溶性淀粉、2%茚三酮溶液、Hanks液（无钙、镁离子，pH7.2）、猪瘟细胞苗等由郑州牧业工程高等专科学校生物技术实验室提供；猪瘟正向间接血凝（IHA）抗体检测试验盒购自中国科学院兰州兽医研究所。试验动物：清洁级小白鼠、家兔购自郑州大学实验动物中心，试验猪由郑州天一高科生物技术有限公司新郑猪场提供。

1.2 猪脾TF制备工艺

透析法：取新鲜猪脾脏，去除表面脂肪和筋膜，用0.3%苯酚生理盐水浸洗后，用灭菌生理盐水清洗3次，剪碎后称重。加等量灭菌生理盐水，用高速组织捣碎机高速匀浆2次，每次1 min，置-20 ℃反复冻融3次，5 000 r/min离心30 min，取上清液置于透析袋中，用等量去离子水于4 ℃透析24 h，收集透析袋外液，并用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌即得猪脾TF。-20 ℃保存备用。

1.3 猪脾TF理化特性检测

观察提取的猪脾TF的颜色、气味及表观性状，并测定样品pH；蛋白质反应采用磺基水杨酸法，取适量样品加入等量20%磺基水杨酸，观察有无白色混浊物出现；鉴别反应采用茚三酮显色法，取2 mL样品加入适量2%茚三酮溶液数滴，加热后观察有无颜色变化；采用Folin-酚法检测样品中多肽含量；参照《中国生物制品规程》检测样品中核糖含量[10]；采用紫外分光光度计测定样品中核苷酸与多肽的比值，判断标准为样品在（251±1） nm处有最大吸收度，且OD260 nm/OD280 nm≥2.0。

1.4 猪脾TF的生物学特性检测

1.4.1 毒性试验 取40只小白鼠，平均分成4组，第1组为对照组，每只小鼠腹腔注射0.20 mL灭菌生理盐水；第2、3、4组为试验组，分别腹腔注射0.10、0.15、0.20 mL的猪脾TF，连续观察7 d，且48 h内不得有死亡。

1.4.2 热原检验 取家兔9只，平均分为3组，每只测量正常体温后15 min内自耳缘静脉缓缓注入预热至38 ℃的猪脾TF，剂量为按家兔每千克体重注射2 mL，每隔30 min测量体温1次，连测3次。

1.4.3 抗原性检验 将制备的猪脾TF与等量不完全弗氏佐剂混合，经乳化后制成油包水的乳剂，稳定性检测合格后，皮下多点注射6只家兔（1 mL/只），每隔1周注射1次，连续注射4次，第4次注射1周后采血，分离血清，通过双向琼脂扩散法检测家兔体内是否产生相应抗体。

1.4.4 小鼠巨噬细胞吞噬功能试验 取体重18～22 g的小白鼠30只，随机分为试验组和对照组，每组15只。每只小鼠腹腔注射0.5%淀粉生理盐水溶液（取0.5 g可溶性淀粉加入适量蒸馏水中并微沸2 min，冷却后加入0.9 g NaCl并定容至100 mL）0.5 mL，每天1次，连续注射3次，以诱导试验组和对照组小鼠腹腔产生巨噬细胞。之后试验组每只小鼠腹腔注射自制猪脾TF 2 mL，对照组注射等量生理盐水；12 h后，每只小鼠腹腔注射1%鸡红细胞悬液1 mL。间隔1 h后，颈椎脱臼处死小鼠，正中剪开腹壁皮肤，经腹膜注入生理盐水1 mL，轻轻按揉鼠腹部1 min，吸出腹腔洗液 0.5 mL，滴于洁净载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，置37 ℃温育30 min。用生理盐水漂洗，除去未粘片细胞，晾干。油镜下计数100个巨噬细胞，并按下列公式计算巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数。采用t检验处理吞噬率和吞噬指数。

吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100×100%

吞噬指数=100个巨噬细胞中吞噬的鸡红细胞总数/100

1.4.5 E玫瑰花环试验 取小鼠肝素抗凝血（小鼠摘眼球采血后以10 IU/mL的比例加入肝素钠）2 mL，置37 ℃水浴自然沉淀30～40 min，吸取全部血浆（约1 mL），于血浆中加入适量Hanks液，洗涤，1 500 r/min离心5～10 min，弃上清液，重复洗涤4次，沉淀均匀即为淋巴细胞悬液。取适量的绵羊肝素抗凝血，加数倍Hanks液洗涤3次，最后以Hanks液配成10%绵羊红细胞悬液，4 ℃保存。取0.1 mL淋巴细胞悬液，加10%绵羊红细胞悬液0.1 mL，加入猪脾TF 0.1 mL作为试验组，对照组中不加猪脾TF，其余与试验组相同。将试验组和对照组均置于37 ℃水浴10 min，然后低速离心（600 r/min）5 min，吸弃多余上清液后，置4 ℃冰箱2～4 h。取出后，将沉淀轻轻摇起，加0.8%戊二醛0.1 mL，混匀后4 ℃固定15 min。将干净玻片用Hanks液沾湿，滴一小滴混悬液，让其自然散开即可。自然干燥后，用姬姆萨-瑞氏液染色，水洗，干燥镜检。在显微镜下分别计数试验组与对照组E玫瑰花环形成数（凡淋巴细胞周围结合3个或3个以上绵羊红细胞者即为阳性），共检查200个淋巴细胞，并按下列公式计算E玫瑰花环形成率。所有数据均采用t检验处理。

E玫瑰花环形成率=形成花环的淋巴细胞数/淋巴细胞总数×100%

1.4.6 猪脾TF对体液免疫效果的影响 将40头25日龄仔猪平均分为对照组与试验组，于免疫前1 d对每头仔猪采血，以正向间接血凝试验法测定每头猪的猪瘟抗体滴度及各组的平均抗体水平。每头仔猪注射猪瘟疫苗1头份，其中试验组每头仔猪于免疫同时加注1 mL自制猪脾TF。免疫后21 d再次采血，检测每头猪的猪瘟抗体滴度及各组的平均抗体水平。采用SPSS软件对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 理化特性检测结果

所制备的猪脾TF为淡黄色的透明状液体，并有淡淡的腥味，其pH 6.3；蛋白质反应未出现混浊或沉淀，说明猪脾TF中不含大分子蛋白质；在猪脾TF中加入适量茚三酮溶液并加热后，呈现紫色；利用Folin-酚法以及参照《中国生物制品规程》，分别测得猪脾TF中多肽含量为3.15 mg/mL，核糖含量为13.22 μg/mL；将制备的猪脾TF稀释15倍后，利用紫外分光光度计测得OD260 nm/OD280 nm=2.09，符合要求。

2.2 生物学特性检测结果

2.2.1 毒性试验 利用不同剂量猪脾TF对小白鼠进行注射处理，7 d后，试验组及对照组小白鼠精神、采食等均表现正常，无一例死亡，经剖检后观察心脏、肝脏、肺脏、肾脏等脏器均无明显异常病变（表1）。证明制备的猪脾TF安全、无毒，可以在临床上使用。

2.2.2 热原检验 由表2可知，所有家兔在注射猪脾TF后的1.5 h内体温变化均未超过0.6 ℃，即热原检验结果呈阴性。

2.2.3 抗原性检验 经双向琼脂扩散法检验，所制备的猪脾TF未能使家兔体内产生相应抗体，说明猪脾TF不具有抗原性。

2.2.4 小鼠巨噬细胞吞噬功能试验 通过镜检可发现，对照组中发生吞噬作用的巨噬细胞明显较试验组中的少（图1）。经过统计、计算，试验组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数与对照组相比均有明显提高，且差异显著（P<0.05）（表3）。

2.2.5 E玫瑰花环试验 经统计学处理可知，加入猪脾TF的试验组中E玫瑰花环形成数和E玫瑰花环形成率较对照组均有明显提高，差异极显著（P<0.01）（表4）。

2.2.6 猪脾TF对体液免疫效果的影响 由表5可见，免疫前试验组与对照组的猪瘟抗体平均滴度（用以2为底的对数值表示，下同）均为4.45；免疫后21 d，对照组的抗体平均滴度测量值达到5.05，而试验组的抗体平均滴度测量值则达到6.35，免疫后分别上升了0.60和1.90，经显著性检验，两者差异显著（P<0.05）。

3 小结与讨论

将新鲜健康猪脾组织经高速组织捣碎机高速匀浆多次，再经反复冻融、离心、透析、过滤除菌，可制得猪脾TF，此法简便、成本低廉、不需要特殊的器材和设备。此外，由于TF在常温下易失活，因此，相关操作（如离心、透析）应在低温下进行。利用透析法制备的猪脾TF无毒性、无热原、无抗原性，符合兽医的临床用药标准。但是在实际生产中，猪脾脏的来源广泛，很难确保脾脏组织中不含细菌、病毒等微生物，而采用过滤法并不能保证将各类微生物尤其是病毒完全去除，并且过滤法会延长操作时间，不利于实际生产。因此，应进一步探索采取更加简便、有效的方法去除组织中的各类微生物。经试验证明，此次制备的猪脾TF能够显著增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，增加E玫瑰花环形成数。说明TF能够增强动物的非特异性免疫能力，并能够增强T淋巴细胞的免疫活性。畜禽在接种疫苗后5～7 d才能产生有效的抗体，在这段时间内机体的抗体水平低，抗病能力差，一旦有病原体感染则很容易发病，如果在这段免疫间隙期内使用TF则能有效增强动物的抗病能力。此外，初生动物的免疫功能尚未健全，如果在初生动物中使用成年动物的TF，则能够增强初生动物的抗病能力，如崔恒宓等[11]通过试验证明，初生仔猪注射成年猪TF可将成年猪的免疫功能尽早转移给仔猪，从而促进仔猪的免疫功能发育。有报道指出，TF能够增强B淋巴细胞的活性，从而增加机体的体液免疫抗体滴度[12]。本试验结果也表明，在进行猪瘟免疫时配合使用TF，可改善猪的免疫机能，显著提高其抗体滴度，从而有效提高猪瘟疫苗的免疫效果，值得在生猪免疫中推广使用。但是本试验中猪脾TF以1 mL/只的剂量进行使用是否最佳，以及母源抗体水平高低对猪脾TF作用效果有无影响尚需进一步研究证实。通过检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力和E玫瑰花环形成试验，虽能在一定程度上测定猪脾TF的免疫活性，但是这些试验结果的判定都存在一定的主观性，且试验重复性受到不同批次试验动物免疫状态差别的影响，因此，建立适宜的动物模型和简便有效的活性测定方法，将是今后研究的重点。

参考文献：

[1] LAWRENCE H S.The transfer in humans of delayed skin sensitivity to streptococcial M substances and to tuberculin with disrupted leucocytes [J].J Clin Invest，1955，34（2）：219-230.

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[5] KIRKPATRICK C H， ROZZO S J， MASCALI J J， et al. Murine transfer factor.Ⅱ.Transfer of delayed hypersensitivity to synthetic antigens [J].J Immunol，1985，134（3）：1723-1727.

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[7] 藏广田.应用TF对人工感染鸡新城疫和鸡传染性喉气管炎治疗试验初报[J].河南畜牧兽医，1981（1）：12-13.

[8] 李学良，刘润珍，李炳云，等.动物TF的研制与临床应用[J].中国兽医科技，1995（10）：22-23.

[9] 郭宝福，郭 鑫，高 爽.TF对奶牛隐性乳房炎的疗效观察[J].中国兽医杂志，1993（5）：21-22.

[10] 中国生物制品标准化委员会.中国生物制品规程[M].北京：化学工业出版社，2000.

[11] 崔恒宓，金韶华，毛九德，等.猪脾转移因子的部分生化和免疫性及其应用[J].畜牧兽医学报，1994，25（4）：317-322.

[12] 乔彦良.动物转移因子研究与在畜禽疫病防治中的应用[J].中国禽业导刊，2002，19（23）：45-47.

2.2.5 E玫瑰花环试验 经统计学处理可知，加入猪脾TF的试验组中E玫瑰花环形成数和E玫瑰花环形成率较对照组均有明显提高，差异极显著（P<0.01）（表4）。

2.2.6 猪脾TF对体液免疫效果的影响 由表5可见，免疫前试验组与对照组的猪瘟抗体平均滴度（用以2为底的对数值表示，下同）均为4.45；免疫后21 d，对照组的抗体平均滴度测量值达到5.05，而试验组的抗体平均滴度测量值则达到6.35，免疫后分别上升了0.60和1.90，经显著性检验，两者差异显著（P<0.05）。

3 小结与讨论

将新鲜健康猪脾组织经高速组织捣碎机高速匀浆多次，再经反复冻融、离心、透析、过滤除菌，可制得猪脾TF，此法简便、成本低廉、不需要特殊的器材和设备。此外，由于TF在常温下易失活，因此，相关操作（如离心、透析）应在低温下进行。利用透析法制备的猪脾TF无毒性、无热原、无抗原性，符合兽医的临床用药标准。但是在实际生产中，猪脾脏的来源广泛，很难确保脾脏组织中不含细菌、病毒等微生物，而采用过滤法并不能保证将各类微生物尤其是病毒完全去除，并且过滤法会延长操作时间，不利于实际生产。因此，应进一步探索采取更加简便、有效的方法去除组织中的各类微生物。经试验证明，此次制备的猪脾TF能够显著增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，增加E玫瑰花环形成数。说明TF能够增强动物的非特异性免疫能力，并能够增强T淋巴细胞的免疫活性。畜禽在接种疫苗后5～7 d才能产生有效的抗体，在这段时间内机体的抗体水平低，抗病能力差，一旦有病原体感染则很容易发病，如果在这段免疫间隙期内使用TF则能有效增强动物的抗病能力。此外，初生动物的免疫功能尚未健全，如果在初生动物中使用成年动物的TF，则能够增强初生动物的抗病能力，如崔恒宓等[11]通过试验证明，初生仔猪注射成年猪TF可将成年猪的免疫功能尽早转移给仔猪，从而促进仔猪的免疫功能发育。有报道指出，TF能够增强B淋巴细胞的活性，从而增加机体的体液免疫抗体滴度[12]。本试验结果也表明，在进行猪瘟免疫时配合使用TF，可改善猪的免疫机能，显著提高其抗体滴度，从而有效提高猪瘟疫苗的免疫效果，值得在生猪免疫中推广使用。但是本试验中猪脾TF以1 mL/只的剂量进行使用是否最佳，以及母源抗体水平高低对猪脾TF作用效果有无影响尚需进一步研究证实。通过检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力和E玫瑰花环形成试验，虽能在一定程度上测定猪脾TF的免疫活性，但是这些试验结果的判定都存在一定的主观性，且试验重复性受到不同批次试验动物免疫状态差别的影响，因此，建立适宜的动物模型和简便有效的活性测定方法，将是今后研究的重点。

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[12] 乔彦良.动物转移因子研究与在畜禽疫病防治中的应用[J].中国禽业导刊，2002，19（23）：45-47.

2.2.5 E玫瑰花环试验 经统计学处理可知，加入猪脾TF的试验组中E玫瑰花环形成数和E玫瑰花环形成率较对照组均有明显提高，差异极显著（P<0.01）（表4）。

2.2.6 猪脾TF对体液免疫效果的影响 由表5可见，免疫前试验组与对照组的猪瘟抗体平均滴度（用以2为底的对数值表示，下同）均为4.45；免疫后21 d，对照组的抗体平均滴度测量值达到5.05，而试验组的抗体平均滴度测量值则达到6.35，免疫后分别上升了0.60和1.90，经显著性检验，两者差异显著（P<0.05）。

3 小结与讨论

将新鲜健康猪脾组织经高速组织捣碎机高速匀浆多次，再经反复冻融、离心、透析、过滤除菌，可制得猪脾TF，此法简便、成本低廉、不需要特殊的器材和设备。此外，由于TF在常温下易失活，因此，相关操作（如离心、透析）应在低温下进行。利用透析法制备的猪脾TF无毒性、无热原、无抗原性，符合兽医的临床用药标准。但是在实际生产中，猪脾脏的来源广泛，很难确保脾脏组织中不含细菌、病毒等微生物，而采用过滤法并不能保证将各类微生物尤其是病毒完全去除，并且过滤法会延长操作时间，不利于实际生产。因此，应进一步探索采取更加简便、有效的方法去除组织中的各类微生物。经试验证明，此次制备的猪脾TF能够显著增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，增加E玫瑰花环形成数。说明TF能够增强动物的非特异性免疫能力，并能够增强T淋巴细胞的免疫活性。畜禽在接种疫苗后5～7 d才能产生有效的抗体，在这段时间内机体的抗体水平低，抗病能力差，一旦有病原体感染则很容易发病，如果在这段免疫间隙期内使用TF则能有效增强动物的抗病能力。此外，初生动物的免疫功能尚未健全，如果在初生动物中使用成年动物的TF，则能够增强初生动物的抗病能力，如崔恒宓等[11]通过试验证明，初生仔猪注射成年猪TF可将成年猪的免疫功能尽早转移给仔猪，从而促进仔猪的免疫功能发育。有报道指出，TF能够增强B淋巴细胞的活性，从而增加机体的体液免疫抗体滴度[12]。本试验结果也表明，在进行猪瘟免疫时配合使用TF，可改善猪的免疫机能，显著提高其抗体滴度，从而有效提高猪瘟疫苗的免疫效果，值得在生猪免疫中推广使用。但是本试验中猪脾TF以1 mL/只的剂量进行使用是否最佳，以及母源抗体水平高低对猪脾TF作用效果有无影响尚需进一步研究证实。通过检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力和E玫瑰花环形成试验，虽能在一定程度上测定猪脾TF的免疫活性，但是这些试验结果的判定都存在一定的主观性，且试验重复性受到不同批次试验动物免疫状态差别的影响，因此，建立适宜的动物模型和简便有效的活性测定方法，将是今后研究的重点。

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