银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的体外抑菌作用

姜迎春,李含薇,李咏梅,曲 莉,黄相道

(1.北华大学口腔医学院口腔内科教研室,吉林吉林 132013; 2.北华大学公共卫生学院劳动卫生学教研室,吉林吉林 132013)

银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的体外抑菌作用

姜迎春1,李含薇1,李咏梅1,曲 莉2,黄相道1

(1.北华大学口腔医学院口腔内科教研室,吉林吉林 132013; 2.北华大学公共卫生学院劳动卫生学教研室,吉林吉林 132013)

目的:探讨银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的体外抑菌活性,为研制开发治疗牙周病的新型纯中药抗菌药物提供药理学依据。方法:本实验分为阴性对照组、亚胺培南对照组和不同浓度及剂型的银杏叶提取物组。采用溶剂提取法制取银杏叶提取物,采用打孔法和试管法在厌氧环境下检测银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的体外抑菌活性,并与金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌对比。通过观察抑菌环直径和测定最小抑菌浓度(MIC)衡量银杏叶提取物的体外抑菌作用。结果:在抑菌环实验中,银杏叶提取物、银杏叶片和银杏叶软胶囊的原液和1∶4的稀释液作用于牙龈卟啉单胞菌,抑菌环直径随着浓度的降低而减小,银杏叶提取物的最大抑菌直径为16.5 mm,银杏叶片和软胶囊最大抑菌直径分别为15.3和14.5 mm,银杏叶提取物抑菌直径明显大于银杏叶片和银杏叶软胶囊(P＜0.05),银杏叶片与银杏叶软胶囊抑菌直径比较差异无统计学意义(P＞0.05);大肠埃希菌组和金黄色葡萄球菌组得到同样的结果。MIC测定,银杏叶提取物组内比较,银杏叶提取物浓度高于1.95 mg·L－1时,试管内均无牙龈卟啉单胞菌生长,而大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌仍可以生长,浓度高于6.25和12.5 mg·L－1时大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌不生长,银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用优于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌。结论:银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌具有抑菌作用。

银杏叶提取物;抑菌作用;牙龈卟啉单胞菌;金黄色葡萄球菌;大肠埃希菌

银杏(Ginkgo Biloba L.)是我国特有植物,其药用价值最高的部分是银杏叶,银杏叶提取物(extract of Ginkgo biloba leaves,EGb)含有多种活性成分,如银杏黄酮、银杏内酯和银杏酸等[1],其中具有抗炎作用的主要成分是银杏总黄酮(total flavone of ginkgo,TFG)[2],现广泛用于临床治疗心脑血管疾病,具有抗氧化、拮抗血小板活化因子和改善血液流变特性等药理活性,对心血管疾病、哮喘和外周血管闭塞性疾病等有显著临床疗效[3-5],同时具有解痉抗过敏和抑制金黄葡萄球菌、绿脓杆菌、变形链球菌、真菌以及抗病毒等作用[6-8]。目前国内外研究焦点主要集中在银杏叶提取物的化学成分及药理活性和抑制需氧菌方面,对其抑制牙周厌氧菌的研究报道尚不多见。而牙周主要致病菌是牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis),本研究旨在探讨银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的体外抑菌活性,为寻找中药牙周抗菌制剂、开发我国丰富的银杏叶资源提供科学的理论依据和实验数据。

1 材料与方法

1.1 药物、菌株、主要试剂和仪器

新鲜银杏叶于2012年5月采集于吉林省吉林市林业局院内银杏叶树;银杏叶片(每片220 mg,含总黄酮醇甘19.2 mg、萜类内酯4.8 mg,唐山福乐药业有限公司生产,生产批号:130605);银杏叶软胶囊(商品名金保通,每粒0.5 g,相当于银杏叶提取物40 mg,石家庄市华新药业有限公司生产,生产批号:101202);亚胺培南(粉针剂: 0.5 g/瓶,印度兰伯西实验室有限公司)。牙龈卟啉单胞菌厌氧干冻菌株,其模式株为ATCC33277,购于首都医科大学口腔微生物实验室;金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)由北华大学医学部微生物教研室提供。胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸膏、氯化钠、L-半胱氨酸、琼脂、双蒸水、氯化血红素、氢氧化钠、VK1和脱纤维羊血(长春鼎国生物技术有限责任公司);厌氧指示剂、厌氧发生袋、厌氧培养袋;索氏抽提器(上海启前电子科技有限公司);H H恒温水浴锅(江苏金坛中大仪器厂); 721分光光度计(上海第三分析仪器厂);ZFQ-5A真空干燥箱(天津玻璃仪器厂),厌氧培养箱(南京斯特试验设备有限公司)。

1.2 银杏叶药物提取和成品配制及菌液、厌氧血琼脂培养基(CDC)的配制

1.2.1 实验用各种溶液配制 银杏叶提取物的获得:将新鲜银杏叶片去杂,水洗,晾干,粉碎,称20 g,置于滤纸桶中,放在索氏抽提器中,用20%乙醇充分溶解,在80℃水浴箱抽提,时间48 h,得墨绿色浸膏,用中性滤纸(Φ12.5 cm)过滤,滤速为中速,型号为102,得棕褐色溶液,分别置于60℃恒温水浴箱中干燥10 d,再置于真空干燥箱,得棕褐色干粉,称质量为2 321.1 mg。取2.2 g, 用4.4 m L、75%乙醇配成乙醇溶液500 mg·L－1备用。银杏叶片乙醇溶液的配制:取银杏叶片10粒,去被膜研磨成粉末,称质量为2.2 g,用4.4 m L、75%乙醇配成乙醇溶液500 mg·L－1备用。银杏叶软胶囊中银杏叶提取物的浓度相当于80 g·L－1,用75%乙醇配成500 mg·L－1溶液备用。亚胺培南溶液的配制:粉剂加灭菌生理盐水配成浓度为100μg·L－1溶液备用。

1.2.2 CDC和肉汤培养基的制备 胰蛋白胨1.5 g,大豆蛋白胨0.5 g,酵母浸膏0.5 g,氯化钠0.5 g·L－1,半胱氨酸40 mg,琼脂1.6 g,双蒸水100 m L,调p H值至7.5,高压灭菌15 min,冷却至50℃,在无菌室内加入无菌脱纤维羊血5 m L,氯化血红素50μL,VK11μL。分别配制成CDC和肉汤培养基备用。

1.2.3 菌种复苏和菌液配制 消毒菌种安瓶口,用砂轮打开,吸200μL CDC肉汤培养基加入安瓶溶解菌种,分别吸50 m L已溶解的菌种分别加入2支装有CDC和肉汤培养基的试管中,滴加CDC平板2滴涂开,置于有厌氧发生袋和厌氧指示剂的厌氧培养袋中,在厌氧培养箱中培养5 d,观察菌落生长。用灭菌0.9%NaCl制成1×106～1×107CFU·m L－1菌液备用。另取已培养的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌菌落,用无菌生理盐水制成1×106～1×107CFU·m L－1的菌液备用。

1.3 实验操作过程

1.3.1 银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的体外抑菌活性 参考美国国立临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的药敏试验(AST)标准[5]进行判断,以抑菌环直径＞20 mm为极敏,抑菌环直径15～20 mm为高敏,抑菌环直径10～14 mm为中敏,抑菌环直径＜10 mm为低敏,无抑菌环为耐药。将CDC在装有厌氧培养箱的洁净工作台操作,制成4个培养皿,每个培养基取菌液50μL,用无菌涂布棒涂匀,待自然干燥后,用灭菌的打孔器在培养基上打孔,中间1个孔,周围1个孔,中间孔为1号,周围孔为2号,4个培养基的1号孔分别滴入银杏叶提取物的药物原液15μL、银杏叶片原液15μL、银杏叶软胶囊原液15μL、亚胺培南15μL;2号孔分别滴入上述4种药物的1∶4的稀释液,以注入孔内平培养基平面为宜。4个培养基均置于厌氧培养袋内,置于37℃培养箱中培养16 h,观察抑菌环直径并记录,每组药物平行重复8次实验。

1.3.2 银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的体外最小抑菌浓度(MIC) 洗后的试管121℃高压灭菌,平均分为4组,每组分成1～10号,用记号笔标明,其中10号为空白阳性对照,即不加各种药品,只加菌液和等量液体培养基。采用微量液体稀释法,将药品原液进行对倍梯度稀释,用无菌微量加样器吸取呈梯度稀释的各种药液自1～9号按其浓度递减加入试管中,加入的药物分别是银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶软胶囊和亚胺培南,放于厌氧培养袋内,置于37℃厌氧培养箱中培养48 h,观察细菌生长情况,确定无菌生长的最低药物浓度,即MIC。

1.3.3 银杏叶提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的体外抑菌活性 用上述2种方法分别测定银杏叶提取物的原液和1∶4的稀释液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌作用,亚胺培南作为对照组。

1.4 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。抑菌环直径以±s表示,组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌体外抑菌效果

银杏叶提取物原液和1∶4的稀释液抑菌环直径分别为16.5和16.2 mm(图1A,见插页五);银杏叶片原液和1∶4的稀释液抑菌环直径分别为15.3和15.1 mm(图1B,见插页五);银杏叶软胶囊原液及1∶4的稀释液抑菌直径分别为14.5和13.2 mm(图1C,见插页五);亚胺培南原液及1∶4的稀释液抑菌环直径分别为25.5和20.3 mm(图1D,见插页五)。

根据AST标准进行判断,牙龈卟啉单胞菌对银杏叶提取物、银杏叶片原液和其1∶4稀释液均表现为高敏;对银杏叶软胶囊原液及稀释液均表现为中敏;对亚胺培南原液及稀释液均表现为极敏。

2.2 银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的体外MIC

肉眼观察阳性对照管有细菌生长(混浊)用“＋”表示,阴性对照管无菌生长(透明)用“－”表示,实验组无菌的最高稀释度所对应的抗(抑)菌剂浓度为该药物对受试菌的MIC。测定银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶软胶囊对牙龈卟啉单胞菌的MIC, 在10个试管中银杏叶提取物第8个试管混浊、银杏叶片第6个试管混浊、银杏叶软胶囊第4个试管混浊,而亚胺培南在第9个试管混浊,第10个试管为空白阳性对照均为混浊状,故上述MIC分别是小一号试管中的药液浓度,即银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶软胶囊和亚胺培南MIC的试管号分别为第7、5、3和8,所对应的药物浓度分别是1.95、7.81、31.25和0.04 mg·L－1。见表1。

表1 银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶软胶囊及亚胺培南对牙龈卟啉单胞菌的MICTab.1 MIC of extract of Ginkgo biloba leaves,Gingko biloba leaf tablet,Ginkgo biloba soft capsule and imipenem for Porphyromonas gingivalis[ρB/(mg·L－1)]

2.3 银杏叶提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的体外抑菌效果

银杏叶提取物原液和1∶4的稀释液对金黄色葡萄和大肠埃希菌抑菌效果的实验结果显示:金黄色葡萄球菌对银杏叶提取物原液表现为高敏、大肠埃希菌表现为中敏。两者对银杏叶提取物稀释液均表现为低敏,对亚胺培南原液和稀释液均为极敏。见表2。

银杏叶提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的MIC实验结果显示:银杏叶提取物试管中,金黄色葡萄球菌1～4号管未长菌,从5号管开始长菌;大肠埃希菌只有1～3号管未长菌,从4号管开始长菌。结果表明:银杏叶提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌有抑菌作用,其对金黄色葡萄球菌的MIC为6.25 mg·L－1,对大肠埃希菌的MIC 为12.5 mg·L－1。见表3。

表2 银杏叶提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的体外抑菌效果Tab.2 Bacteriostatic effect of Ginkgo biloba extract on Staphylococcus aureus and E.coli in vitro(l/mm)

2.4 银杏叶提取物对不同细菌的抑菌效果比较

不同剂型的药物与不同细菌的各个组间比较:牙龈卟啉单胞菌组,银杏叶提取物、银杏叶片和银杏叶软胶囊的抑菌环直径均大于阴性对照组(P＜0.05),银杏叶提取物组抑菌环直径大于银杏叶片和银杏叶软胶囊组(P＜0.05),银杏叶片组与银杏叶软胶囊组抑菌环直径比较差异无统计学意义(P＞0.05);大肠埃希菌组和金黄色葡萄球菌组得到同样的结果。银杏叶提取物组组内比较显示:银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的抑菌环直径大于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌(P＜0.05),而银杏叶提取物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌环直径比较差异无统计学意义(P＞0.05);银杏叶片组组内比较显示:银杏叶片对大肠埃希菌的抑菌环直径大于金黄色葡萄球菌(P＜0.05),而对牙龈卟啉单胞菌和大肠埃希菌的抑菌环直径比较差异无统计学意义(P＞0.05);银杏叶软胶囊组组内比较结果显示:银杏叶软胶囊对3种菌其均有明显的抑菌作用,对大肠埃希菌最明显,对牙龈卟啉单胞菌次之,对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最差。见表4。

3 讨论

牙周病是口腔的常见病和多发病,其主要致病菌是引起牙周围组织慢性破坏性疾病的始动因子。牙龈卟啉单胞菌是目前公认的牙周致病菌,是牙周微生物领域重点研究的厌氧菌之一,其细菌的抗原成分、各种酶、毒素和许多代谢产物可直接刺激和破坏牙周组织,或引起牙周组织局部的免疫和炎症反应,造成牙周组织损伤[9]。前列腺素E2 (prostaglandin E2)是巨噬细胞、浆细胞等炎性细胞被激活时分泌的炎性介质之一,广泛存在于各病变牙周组织中,与牙周病的发生、发展有密切关系。临床上多选择性地采用抗菌药物作为牙周病的辅助治疗,常用的药物主要为抗生素类的化学制剂,如硝基咪唑类药物、四环素族药物等,而中药制剂应用较少。朱彩莲等[10]研究了17种中药对牙周可疑致病菌的体外抑菌作用,其中包括银杏叶提取物,但并未做进一步的研究和论证。本研究选取不同剂型银杏叶提取物,检测其对牙龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的体外抑菌效果,并进行对比,旨在发现新的牙周抗菌中药制剂。

表3 银杏叶提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的MICTab.3 MIC of Ginkgo biloba extract for Staphylococcus aureus and E.coli[ρB/(mg·L－1)]

表4 银杏叶提取物对3种细菌的抑菌环直径Tab.4 Bacteriostatic ring diameters of extract of Ginkgo biloba leaves for three kinds of bacterial species (n＝8,±s,d/mm)

表4 银杏叶提取物对3种细菌的抑菌环直径Tab.4 Bacteriostatic ring diameters of extract of Ginkgo biloba leaves for three kinds of bacterial species (n＝8,±s,d/mm)

∗P＜0.05 compared with Ginkgo biloba extract group;△P＜0.05 compared with negative control group;＃P＜0.05 compared with Prophyromonas gingivalis;○P＜0.05 compared with Staphylococcus aureus;▲P＜0.05 compared with E.coli.

Group Bacterostatic ring diameter Porphyromonas gingivalis E.coli Staphylococcus aureus Ginkgo biloba extract 18.29±1.05△16.57±3.65△＃17.08±0.62△＃9.87±0.18∗△Ginkgo biloba soft capsule 11.05±0.32∗△▲12.59±0.14∗△8.97±1.63∗△▲Positive control 25.50±0.96 35.21±0.62 36.04±0.95 Negative control 6.21±0.14 6.61±0.87 6.42±0.34 Ginkgo biloba leaf tablet 10.42±1.54∗△11.96±1.36∗△○

本研究结果显示:牙龈卟啉单胞菌对银杏叶提取物原液、稀释液和银杏叶片原液、稀释液均表现为高敏;对银杏叶软胶囊原液、稀释液表现为中敏;对亚胺培南原液、稀释液均为极敏。本研究另取银杏叶提取物原液、稀释液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌进行抑菌实验,结果显示:银杏叶提取物原液对金黄色葡萄球菌表现为高敏、对大肠埃希菌表现为中敏,银杏叶提取物稀释液对两者均表现为低敏,对亚胺培南原液、稀释液均为极敏。亚胺培南主要成分是亚胺培南和西司他丁钠,主要用于治疗敏感革兰阳性菌及革兰阴性杆菌所致的严重感染,如败血症、感染性心内膜炎、下呼吸道感染等,是强有效的抗厌氧菌药物,但其对肝、肾损害比较大,并且价格贵。银杏叶是天然药用植物,不仅无毒副作用,而且资源丰富、价格低廉,提取方法简单,易于推广使用。本研究对比不同剂型和浓度银杏叶制剂对牙龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌效果,结果显示:银杏叶提取物原液抑菌效果优于银杏叶片,银杏叶片又优于银杏叶软胶囊。

本研究结果显示:银杏叶提取物、银杏叶片、银杏叶软胶囊和亚胺培南针对牙龈卟啉单胞菌MIC分别为1.95、7.81、31.25和0.04 mg·L－1。银杏叶提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌MIC为6.25和12.5 mg·L－1。除了亚胺培南作为对照外,以上3种银杏叶制剂的MIC为1.95 mg·L－1,表明银杏叶提取物的抑菌效果相对较强。

银杏叶提取物有较强的抑菌效果,分析原因可能是银杏叶提取物总黄酮含量较高。黄酮类化合物指2个苯环通过中央三碳链相互连接而形成的一系列化合物,或以与糖结合成苷的形式,或以游离苷元的形式广泛存在于植物界中[11]。黄酮类化合物除了其药用价值外,也有抑菌效应。项昭保等[12]和曲中堂等[13]研究了野生橄榄黄酮的抑菌效应,发现其对痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用;唐浩国等[14]研究了牡丹总黄酮对几种常见微生物的抑菌活性,发现其对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌有一定的抑制作用,其中对沙门氏菌的抑制作用最为显著。总黄酮还具有抑制前列腺素E2的作用。酚类化合物及其衍生物,一般呈弱酸性(p H 6),能使蛋白质凝固或变性,故有杀菌和抑菌作用;酚类物质可通过破坏细菌壁及细胞膜的完整性,导致微生物细胞释放胞内成分引起膜的电子传递、营养吸收、核苷酸合成及ATP活性等功能障碍,从而抑制微生物的生长[11]。黄酮类化合物的化学结构属于酚类衍生物,因而也具有以上特性,从而表现出一定的抑菌功能。另外银杏叶聚戊烯醇(GBP)是继银杏黄酮、萜内酯之后新发现的一类重要天然活性物质,由14～24个异戊烯基单元及终端异戊烯醇组成的线性长链化合物[15],具有提高免疫功能、促进肝细胞再生、抑制癌细胞转移和辅助放化疗等作用[16]。

综上所述,银杏叶提取物对牙龈卟啉单胞菌的体外抑菌效果好,无毒副作用,且银杏叶天然资源丰富,提取简便,价格便宜,易于推广和临床使用,其合理的组分和剂型将有待于进一步研究和验证。

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Bacteriostatic effect of extract of Ginkgo Ailoba leaves on Porphyromonas gingivalis in vitro

JIANG Ying-chun1,LI Han-wei1,LI Yong-mei1,QU Li2,HUANG Xiang-dao1
(1.Department of Oral Medicine,School of Stomatology,North China University,Jilin 132013,China; 2.Department of Labor Hygiene,School of Public Health,North China University,Jilin 132013,China)

ObjectiveTo explore the antibacterial activity of extract of Ginkgo biloba leaves on Porphyromonas gingivalis in vitro,and to provid pharmacological reference for developing a new type of antibacterial drugs in the treatment of periodontal disease.MethodsThis experiment was divided into negative control group,imipenem control group and different concentrations and forms of extract of Ginkgo biloba leaves groups.Solvent extraction method was used to extract the extract of Ginkgo biloba leaves,punching method and test tube method were performed to detect the antibacterial activity of extract of Ginkgo biloba leaves in anaerobic environment in vitro and compared with Staphylococcus aureus and E.coli.By observing the antibacterial ring diameter and determination of the minimum bacteriostasis concentration(MIC),the antibacterial activities of extract of Ginkgo biloba leaves in vitro were measured.ResultsIn the experiment of bacteriostatic ring,Porphyromonas gingivalis was treatedwith extract of Ginkgo biloba leaves,Ginkgo biloba leaf tablet and Ginkgo biloba soft capsule concentrate and 1∶4 diluent,the bacteriostatic ring diameters were decreased with the decreasing of the concentration.The maximum bacteriostatic diameter of Ginkgo biloba extract was 16.5 mm,and the maximum bacteriostasis diameters of Ginkgo biloba leaf tablet and soft capsule were 15.3 and 14.5 mm,respectively;the bacteriostatic diameter of the exact of Ginkgo biloba leaves was bigger than those of Ginkgo biloba leaf tablet and Ginkgo biloba soft capsule(P＜0.05), but there was no statistical difference of bacteriostatic diameter between Ginkgo biloba leaf tablet and Ginkgo biloba soft capsule(P＞0.05);E.coli and Staphylococcus aureus groups get the same results.When the concentration of extract of Ginkgo biloba leaves was more than 1.95 mg·L－1,there was no growth of Porphyromonas gingivalis but E.coli and Staphylococcus aureusa still grew;only the concentrations of exact of Girkgo biloba leaves were more than 6.25 and 12.5 mg·L－1,E.coli and Staphylococcus aureus didn’t grow;the bacteriostatic effect of extract of Ginkgo biloba on Porphromonas gingivalis was better than E.coli and Staphylococcus aureus.ConclusionExtract of Ginkgo biloba leaves has antibacterial effect on Porphyromonas gingivalis.

extract of Ginkgo biloba leaves;antibacterial activity;Porphyromonas gingivalis;Staphylococcus aureus;Escherichia coli

R285;R78

A

2013-12-09

吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题(20130206036YY);吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目资助课题(吉教科合字[2012]第163号)

姜迎春(1970－),男,吉林省延吉市人,主治医师,在读医学硕士,主要从事牙周病学方面的研究。

李含薇(Tel:0432-64608113,E-mail:li65575147＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-1018-06

10.13481/j.1671-587x.20140522