水解超高产大豆“中黄35”功能性蛋白的制备

葛杰，陈虎，刘超，苏豫梅

(新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052)

水解超高产大豆“中黄35”功能性蛋白的制备

葛杰，陈虎，刘超，苏豫梅

(新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052)

以新疆超高产大豆“中黄35”品种为研究对象，采取传统提取、酶单因素实验和双酶解法等多种方法制备大豆的功能性蛋白，并对其SDS－PAGE电泳、溶解曲线、氮溶指数和浊度等基本性质进行了初步分析。实验结果表明“中黄35号”大豆蛋白的提取最优条件是:豆水比(g:mL)为1∶13，pH值为8，提取时间为2 h。酸性蛋白酶水解大豆蛋白的最适合工艺条件为:初始pH值为3.5，温度为45℃，酶用量为6%，固液比为1∶8，水解时间为8 h。采用SDS－PAGE电泳分离出2条酸性蛋白条带，其相对分子质量分别在95 kD和60 kD左右。

大豆;功能性蛋白;双酶解法;酸性蛋白

大豆是新疆的主栽农作物之一。大豆蛋白含有多种氨基酸成分，特别是含有人体所必需的8种氨基酸，是一类优质植物蛋白资源。超高产大豆“中黄35”在新疆于2006、2007年创造的产量分别达5 197 kg/hm2和5 577 kg/hm2，2010年在兵团农八师148团试验田更是达到6 088.35 kg/hm2的超高产指标。有研究表明:植物蛋白的结构大都十分紧密，相对分子质量较大，不易被人体消化吸收，吸收率也往往低于动物蛋白;大豆蛋白在酸性条件下(pH值为3.0～4.5)溶解性很差，而酸性饮料的pH值正好在此区间。大豆的蛋白质含量高达40%，且含有丰富的不饱和脂肪酸、钙、磷、铁、膳食纤维等，不含胆固醇，具有很高的营养价值。但目前大豆蛋白质的提取率较低，大多在60%以下。80%～88%的大豆蛋白可溶于水。将大豆蛋白水解后，其相对分子质量减小，结构疏松，更有利于通过人体内酶的作用使吸收率大大提高。目前，关于新疆大豆蛋白在酸性条件下的应用研究不多，特别是对不同方法处理后超高产大豆其酸性蛋白的生理生化性质研究鲜见报道。

本实验采用超高产大豆“中黄35”品种，研究大豆分离蛋白制备方法，旨在提高大豆蛋白质的提取率，研究大豆蛋白质的溶解性受原料加热处理、溶出时的固液比、pH值、温度等条件的影响，优化大豆蛋白的提取工艺，制备大豆功能性蛋白并对其理化性质进行分析。

采用双酶解法研制功能性可溶蛋白，利用SDS－PAGE电泳分析其酸性蛋白的分子量，为功能性大豆蛋白系列产品的开发提供一定的理论依据和方法的指导，使其应用范围更加广泛。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新疆超高产大豆“中黄35号”。

1.2 试验准备

选用伊犁地区伊宁县吉里于孜镇种植推广的“中黄35号”大豆品种，于2012年5月6日播种，每公顷施用150 kg氮磷钾复合肥作为种肥，初花期每公顷追施150 kg尿素。

1.3 测定方法

1)用传统方法分离大豆蛋白。蛋白质提取率=(浆料中蛋白质总量/原料中蛋白质总量)× 100%。采用不同的浸泡pH值、磨浆温度、豆水比和磨浆pH值，试验优化大豆材料的最佳磨浆工艺。

2)用双酶解法研制功能性可溶蛋白。根据pH值适用范围(酸性、中性)，采用2种酶联合水解，分别添加中性蛋白酶和酸性蛋白酶，比较大豆蛋白的水解率大小以确定最优加酶解体系。

3)大豆酸性蛋白氮溶指数的测定。采用Lorry法测定蛋白质含量。

4)大豆酸性蛋白溶解度曲线及浊度的测定。

5)SDS－PAGE电泳分析大豆酸性蛋白分子量。

2 结果与分析

2.1 传统方法分离大豆蛋白。

传统提取方法是采用碱溶酸沉淀法。将脱脂后的低温大豆在碱性条件下溶解，pH值控制在7.5～8.0左右，离心取清液;然后pH值控制在4.5，在酸性条件下让蛋白沉淀，离心取沉淀;再将pH值控制在7.0～7.5左右，所得的凝乳浆在中性条件下溶解，最后喷雾干燥得到成品大豆分离蛋白。

试验表明“中黄35号”大豆蛋白的提取的最优条件是:豆水比为1∶13，pH值为8，提取时间为2 h。大豆蛋白的等电点为4.5～5.0，是酸性蛋白。尽管大豆中含有水溶蛋白、盐溶蛋白、碱溶蛋白和醇溶蛋白，但其主要成分为碱溶蛋白。丙酮可降低溶液的介电常数，破坏蛋白质的水化膜，可使蛋白质在一定条件下沉淀析出;调节蛋白质溶液的pH值到等电点附近，有利于蛋白质的沉淀。大豆总蛋白曲线见图1。

2.2 双酶解法研制功能性可溶蛋白

称取已提取的大豆蛋白100 g，加入去离子水1.5 L，调pH值为8.0后充分搅拌。2 h后9 000 r/min、4℃离心20 min，取上清液调pH值为4.5，此时溶液出现乳白色沉淀。将溶液9 000 r/min、4℃离心20 min，取沉淀，加入10倍(10 mL/g)的去离子水，调pH值为7.0。待沉淀完全溶解后调pH值为4.0～6.0，加入适量植酸酶，30～40℃下水浴振荡30 min，90℃高温灭酶10 min。调pH值为3.0～6.0，加入蛋白酶适量，30～40℃下酶解30 min，90℃高温灭酶10 min，然后高温高压处理15 min，喷雾干燥，得成品功能性大豆蛋白－酸性蛋白。制备的蛋白如图2所示。

图1 “中黄35号”大豆总蛋白曲线

图2 “中黄35”大豆酸性蛋白的制备

随着酶用量的增大，水解液中的氨基氮含量升高。酶用量超过8%以后，大豆蛋白质含量略有下降。这主要是由于酶浓度过大，发生自溶(自水解)现象，导致对底物的水解作用减弱，故取最适酶用量为8%。试验中先加中性蛋白酶，后加酸性蛋白酶，大豆蛋白水解率可达45%。

2.3 大豆酸性蛋白氮溶指数的测定

采用Lorry法测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白(BSA)为标准物做标准曲线测定上清液蛋白浓度，氮溶指数为上清液蛋白浓度与总蛋白浓度的比值。

2.4 大豆酸性蛋白溶解度曲线的测定

测定蛋白分别在pH值为2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0时的氮溶指数，每个样品测定3次取平均值，将各点连成折线即为溶解度曲线(表1和图3)。

表1 “中黄35”大豆酸性蛋白溶解曲线表

图3 “中黄35号”大豆酸性蛋白溶解曲线

2.5 大豆酸性蛋白浊度的测定

蛋白质的浊度表征蛋白溶液外观的透明程度。常见的用紫外/可见分光光度计对某特定波长的光吸收进行测量，吸光度越高，浊度就越大。试验中将功能性蛋白用去离子水配置成1%的溶液，磁力搅拌1 h，用紫外/可见分光光度计在600 nm处测定其吸光值，结果如表2所示。

表2 “中黄35”大豆酸性蛋白浊度表

2.6 SDS-PAGE电泳分析大豆酸性蛋白分子量

凝胶电泳采用Laemmli法，在不连续缓冲系统上进行SDS－PAGE电泳分析，浓缩胶和分离胶的浓度分别为40 g/L和120 g/L，考马斯亮蓝R－250染色。还原电泳样品缓冲液中含10 mmol/L β－巯基乙醇，其他成分与非还原SDS－PAGE电泳缓冲液相同。样品浓度为2‰，上样量为20 μL。采用SDS－PAGE电泳分离出2条酸性蛋白条带，其相对分子质量分别在95 kD和60 kD左右，如图4所示。

图4 “中黄35”大豆酸性蛋白SDS－PAGE电泳分析

3 讨论

大豆功能性蛋白质的溶解性受原料加热处理、溶出时的固液比、pH值、共存盐类、温度等条件的影响。有报道认为:浸提时，加水量越多，蛋白质的提取率就越高;但是加水太多，酸沉时蛋白的损失量增加;加水太少，大豆蛋白的溶出率大大下降，还会增加后续各工序的难度。蛋白质的溶解度与浸提pH值有很大的关系。pH值太低时，蛋白组分解;pH值太高，易发生胱赖反应，生成有毒物质。温度的高低对蛋白收率、纯度及色泽有显著影响。浸提温度过高，会使蛋白变性，同时黏度增加，分离困难，耗能提高。笔者认为浸提时间越长，蛋白的溶出率就越高;但一定的时间后，蛋白制得率随浸提时间的延长而无显著的变化。浆料粒度也被认为是影响蛋白制备的一个因素，浆料粒度太细反而会使蛋白制得率和浸提效果下降，同时增加了过滤分离的难度。加酸速度和搅拌速度不容易控制，试验中到等电点时大豆蛋白质凝集下沉缓慢，试管中上清液混浊。豆水比和浸泡pH值对大豆分离蛋白的提取率具有显著影响。

大豆分离蛋白提取方法较多:①酸沉碱提法是一种传统的分离提取方法，缺陷是耗酸、耗碱量大，废水处理费用高，产品收率低，但依然常用。②膜分离法，根据大豆蛋白的相对分子质量大小、形状及膜与大豆蛋白的适应性，选择膜材料对大豆蛋白提取液超滤分离、超滤净化，喷雾干燥成粉状大豆分离蛋白。③反胶束萃取分离法，利用反胶束技术从全脂豆粉萃取大豆蛋白，可一次萃取50%左右。大豆蛋白反胶束萃取技术的优点明显，主要是选择性高、操作方便、放大容易，反胶束相可循环利用，分离和浓缩同步进行;缺点是蛋白质在现有反胶束体系中稳定性不高，易导致萃取前后蛋白质的活性损失大，制约其工业化应用。④反相高效液相色谱法，Tris(三甲基氨基甲烷缓冲剂)和2－巯基乙醇(分析级)用于分离大豆蛋白。大豆蛋白分离样本可用于组织化蛋白、大豆粉、豆奶、强化婴儿大豆的生产，使用前均要测定其蛋白质含量。样品溶于水，然后于注样前用0.122 μm经无菌处理的多酚滤纸过滤。全部样品和标样保存在3℃或冰冻条件下。样品溶液在分析当天现配，并保存在冰上备用。

4 结论

“中黄35号”大豆蛋白的提取的最优条件是:豆水比为1∶13，pH值为8，提取时间为2 h。酸性蛋白酶水解大豆蛋白的最适工艺条件为:初始pH值为3.5，温度为45℃，酶用量为6%，固液比为1∶8，水解时间为8 h。采用SDS－PAGE电泳分离出2条酸性蛋白条带，其分子量分别在95 kD和60 kD左右。该试验数据为加强超高产大豆深加工中的研究开发，提高农副产品的附加值，以及对功能性大豆蛋白系列产品的进一步研究提供了一定的理论依据和方法的指导。

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(责任编辑 何杰玲)

Hydrolyzed Soy Protein“Medium Yellow 35”Functional Preparation

GE Jie，CHENG Hu，LIU Chao，SU Yu－mei
(College of Agricultural Sciences，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China)

This experiment adopts the super－high－yield“medium yellow 35”soybean varieties in Xinjiang，and adopts the traditional extraction，enzymatic methods such as single factor experiment and double enzyme hydrolysis to obtain the functional protein.The functionality to the preparation of soybean protein，and its biochemical properties include the SDS－PAGE electrophoresis，dissolve curve，nitrogen solubility index and basic properties such as turbidity has carried on the preliminary analysis.Experiments prove that the most optimum extraction conditions for“medium yellow 35”soy protein function are that soybean water ratio is 1∶13，with pH of 8，and extracting time 2 h.The optimum technological condition:initial pH is of 3.5，with temperature of 45℃，dosage of enzyme is of 6%，and solid－to－liquid ratio is 1∶8，and extracting time 8 h.The molecular weights of two acidic proteins are 95 kD and 60 kD respectively by SDS－PAGE.

soybean;functional protein;double enzyme hydrolysis;acidic protein

TS201

A

1674－8425(2014)05－0063－04

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.05.013

2013－12－18

新疆农业大学大学生创新项目“酶解法制备大豆中黄35号酸性蛋白及在苹果醋中的应用”(jqzyp62012154)

葛杰(1978—)，女，新疆乌鲁木齐人，讲师，主要从事植物抗逆分子生物学研究。

葛杰，陈虎，刘超，等.水解超高产大豆“中黄35”功能性蛋白的制备［J］.重庆理工大学学报:自然科学版，2014(5):63－66.

format:GE Jie，CHENG Hu，LIU Chao，et al.Hydrolyzed Soy Protein“Medium Yellow 35”Functional Preparation［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(5):63－66.