妇科门诊人乳头瘤病毒感染基因型分析＊

包常华，张东丽，刘 鑫，崔桂玉，石 凯

(内蒙古民族大学 a.医学院;b.农学院，内蒙古 通辽市 028000)

近代临床和分子生物学的研究已经证实人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发病的主要危险因素［1］。妇科门诊中宫颈癌是严重危害全世界女性的一种恶性疾病，中国每年新增患者数达8.2%［2］。目前已经鉴定的HPV有200余种，其中50多种可以感染生殖道，尤其是高危型别的持续、反复感染与宫颈癌密切相关，因此，HPV病毒感染的早期诊断和早期治疗对宫颈癌的预防至关重要。应用分子生物学技术手段进行病毒感染检测的研究，正逐步发展成为妇科肿瘤预防方面的前沿学科。本研究对2013年6月至2013年12月来我研究所进行HPV感染基因型检测的364例女性宫颈脱落细胞样本进行分析，旨在了解本地区女性HPV感染情况和型别的分布。为进一步开展预防措施，降低该病毒的感染率，从而进一步降低本地区女性宫颈癌的发生率提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象为2013年6月至2013年12月来我研究所进行HPV分型检测的妇科女性患者，共364例，年龄波动范围为21-58岁。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器 HPV DNA提取试剂盒、HPV21快速导流杂交试剂盒、核酸导流快速杂交仪(凯普生物技术有限公司)，PCR扩增仪(Biometra)，微量移液器(eppendorf)。

1.2.2 标本采集 我市计生医院妇科门诊就诊患者以及我校病原生物学研究所进行检查的患者进行采样，采集人员以窥阴器暴露宫颈口，先用棉签擦去宫颈分泌物，再将宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针转动五圈。慢慢去除宫颈刷并将其放入装有细胞保存液的取样管中，标记患者编号及采样日期，4℃保存，并于一周内进行检测。

1.2.3 DNA提取 微量移液器吸取标本500 μL于离心管中，14000 r/min离心5 min，弃去上清液;沉淀中加入溶液Ⅰ400 μL并煮沸15 min;平衡室温后加溶液Ⅱ400 μL，14000 r/min 离心 5 min，弃去上清液;沉淀中加入溶液Ⅲ60 μL静置10 min后14000 r/min离心1 min，溶液中即为DNA溶液。

1.2.4 PCR扩增 上述 DNA溶液1 μL加入分装有24 μL反应液PCR管中，置PCR扩增仪中扩增。反应条件为95℃变性9 min，40个循环(94℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 延伸5 min。

1.2.5 导流杂交 运用凯普生物技术有限公司导流杂交仪进行杂交，具体操作严格按照试剂盒说明进行。可检测出HPV的15种高危型别:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68;和 6种低危型别:HPV6、11、42、43、44，CP8304(81)。

2 结果

2.1 HPV感染率统计

364例标本中阳性例数62例，总阳性率为17.03%(62/364)。共检测到HPV亚型16种，未检出高危型别中的45、51、59型和低危型别中的43、44型。

2.2 HPV DNA亚型分布

共检出HPV高危型别12种，所占比例为80.95%;低危型别4种，所占比例为19.05%。感染HPV患者中以HPV31、HPV18、HPV16三种亚型较为多见，所占比例分别为 13.09% 、11.90% 、10.71% ，具体统计结果见表1。

表1 病毒感染患者HPV单亚型阳性分析Tab.1 Analysis of HPV subtype of patients infected with the virus

2.3 HPV感染人群年龄分布

标本采集人群年龄波动范围为21-58岁，其中以31-40岁年龄组感染率最高，比例为45.16%，随着年龄增大感染率有逐渐下降的趋势，结果见图1所示。

图1 HPV感染人群不同年龄组别分布结果Fig.1 The distribution of HPV infection in population of different age

2.4 HPV的单一感染和多重感染

病毒感染阳性患者中单一感染率为70.97%(44/62)。多重感染率为29.03%(18/62)，其中二重感染阳性率为22.58%(14/62)，三重感染率6.45%(4/62)，未发现四重及以上感染，结果见图2所示。

图2 HPV单一感染与多重感染百分率统计结果Fig.2 The results of the percentage of HPV single infection and multiple infections

3 讨论

本实验检测方法采用基因芯片和导流杂交技术，具有灵敏、特异、简便和快速等特点［3，4］，能准确地进行病毒基因型检测，有效进行预后判断和治疗诊断。经过对采集的宫颈脱落细胞标本进行HPV DNA分型检测后发现:

3.1 HPV感染常见基因型分布存在区域性差异

国际癌症研究协会的调查中发现在宫颈癌患者感染的HPV亚型(数据中不包含中国人)中处于前五位的是 16(57.4%)、18(16.6%)、45(6.8%)、31(4.3%)、33(3.7%)［5］。本研究结果与之存在差异，本地区感染HPV亚型处于前五位的分别是31(13.09%)、18(11.90%)、16(10.71%)、6(9.52%)、52(8.33%)。364 例样本中共检出 HPV感染62例，总感染率为17.03%，与深圳地区的17.5%基本一致［6］，低于浙江台州地区的35.08%、北京地区的57.10%、山西阳泉地区的35.20%以及湖北鄂州市的30.93%［7-10］。已有报道显示在多数亚洲国家 HPV52、58 感染率高于 HPV31、33［11］，本实验结果表明在本地区HPV52、58感染率则低于HPV31型而高于HPV33型。与我国境内的其他省市地区相比较而言，HPV感染的常见亚型存在一定的地区差异:例如浙江台州地区常见亚型为 16、11、52、53、58型［7］，北京地区常见亚型为 16、58、52、53、33 型［8］，湖北鄂州市常见亚型为 16、58、53、42、31/6 型［9］，山西阳泉地区常见亚型为 16、52、58、11、68 型［10］。本研究中内蒙古通辽地区常见亚型为31、18、16、6、52，且处于感染亚型首位的为31型，与上述几个调查地区有差异。有研究表明北京地区以及绍兴地区的女性HPV感染基因亚型除了16、52、58型外，CP8304(81)在该地区常见［10，11］，而在本研究中CP8304(81)阳性率较低(4.76%)。低危型11型在台州以及阳泉地区有较高的感染率，而在本地区的检出率较低。综上列举数据表明HPV感染常见基因亚型分布存在明显的人群和区域性特点。

3.2 HPV多重感染与宫颈疾病相关性

本地区以单一感染为主，所占比例为70.97%，多重感染率为29.03%，与我国其他省市地区的报道结果类似［6-11］。其中以二重感染居多，最多检测出三重感染，未见四重及以上感染样本。目前，关于HPV的多重感染是否会增加宫颈癌的发生还存在争议［9］，为此还需扩大样本量并结合临床，以期得出更为科学客观的结论。生殖道是HPV感染常见的部位之一，同时也是其他妇科病原微生物的寄生之处［12］。有报道表明HPV阳性妇女其它生殖道病原体的感染率高于HPV阴性妇女，细菌性阴道炎在HPV阳性妇女中普遍存在，沙眼衣原体感染也与HPV持续感染具有一定的相关性［10］，支原体可能也在病毒的持续感染中起作用［12］，细菌、病毒等的感染可以引起宫颈炎性病变，宫颈炎性病变也是诱发宫颈癌的高危因素，所以HPV的多重感染或是HPV混合其他生殖道病原微生物的感染是否促进宫颈癌癌前病变及宫颈癌的发生有待进一步研究。

流行病学和生物学研究表明，HPV是宫颈癌的重要致病因，没有HPV的感染就不会发生宫颈癌［13］。根据HPV与宫颈癌发病风险的关系，可将其分为低危型和高危型［14］。低危型可导致生殖器尖锐湿疣，影响生活质量，高危型与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CIN2/3)的发生相关，99.7%的宫颈癌患者中存在高危型HPV感染，且病毒量与宫颈病变的程度有关。包括据世卫组织相关信息和已发表文献数据的统计结果表明，亚洲地区宫颈脱落细胞正常的女性中多见于高危型 16、18、52 的感染［15，16］。本研究中检测所得多见亚型种类与国内外报道的多见亚型种类基本相似，但亚型的分布在我国存在着地区间的差异性，并且所检标本中存在着30.76%的多重感染患者。因此妇女定期进行HPV的体检具有一定的临床应用价值，总之利用杂交的方法进行HPV的DNA分型检测，具有特异、快速、灵敏的特点，是控制和预警宫颈癌发生的有效手段，通过该实验了解本地区人群HPV感染情况及其DNA亚型分布，对于HPV的感染及其诱发的疾病进行早预防、早诊断、早治疗均具有重要意义。

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