具有抑菌活性的海藻多酚联合提取工艺优化研究

杨会成，郑 斌，郝云彬，相兴伟，周宇芳，廖妙飞，李瑞雪

(1.浙江省海洋开发研究院，浙江舟山 316021；2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003；3.舟山出入境检验检疫局，浙江舟山 316100)

海藻生活在特殊生态环境下，在其进化过程中产生了与陆上生物不同的代谢和机体防御系统，普遍含有特殊功能的生物活性物质如酚类、吲哚类、萜烯类等化合物，是海洋天然产物的重要来源。其中海藻多酚是一大类结构不同、含有多羟基的化合物，由多种简单酚结构单元组成。它作为天然食品添加剂中的抗氧化剂、防腐剂等方面具有重要的意义[1-4]。此外，海藻多酚还具有抗肿瘤、抗病毒、化学防御、除臭等生物活性。目前，人们已发现海藻多酚在红藻、褐藻、蓝藻、绿藻中均有分布，其中以褐藻中含量较大，种类较多，包括马尾藻、鼠尾藻、海带、海黍子、裙带菜、羊栖菜等。海藻多酚的提取方法主要有极性溶剂提取法、超临界提取法等[3,6-7]。但是目前国内外关于海藻多酚提取方法的系统研究报道还不多见。

海带具有分布广、藻体大、生长快等特点，含有多种保鲜成分和功能性物质，是我国优势海洋生物资源，养殖产量居世界首位，但目前对其高值化利用程度低，且加工过程中产生的废弃物对环境也造成很大污染。因此，以海带、鼠尾藻等野生海藻为原料制备海藻多酚保鲜防黑变抑制剂，不但可以克服含硫违法添加剂的使用及残留问题，又能有效抑制甲壳类黑变现象，延长其货架期，提升商品价值，同时提高藻类的附加值。

本文运用超声波、微波等提取手段，通过多种因素分析比较确定海藻多酚的最佳浸提工艺参数，为海藻多酚和海藻的综合利用提供基础技术资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜海带和鼠尾藻采自于舟山嵊泗；南美白对虾购自于舟山北门水产市场。

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾志贺菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌、白色念珠菌、青霉、灰霉、黄曲霉，由中科院微生物所提供。

1.2 主要试剂

酒石酸钾钠、七水合硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、没食子酸丙酯、无水乙醇，均为分析纯。无菌生理盐水、营养琼脂培养基、PDA培养基。

1.3 主要仪器设备

分光光度计，超声波清洗器，多功能微波炉，组织捣碎匀浆机，恒温水浴摇床，电热压力蒸汽灭菌器，智能生化培养箱，等。

1.4 海藻多酚类物质的提取[8-12]

新鲜海藻先用清水洗去表面附着物，自然风下晾干，后用组织匀浆机打碎备用。

称取上述匀浆200 g，放入烧杯中加入400 mL 80%乙醇，搅拌均匀，放在超声波处理器或多功能微波炉（设置为低火）中处理一段时间（单一方式使用时间为6 min，联合使用时各处理3 min）。再放入60℃水浴摇床中，100 r/min，闭光浸提1 h。最后抽滤，滤渣重复浸提，合并滤液，再经减压浓缩除去乙醇，浓缩液冷冻干燥即得海藻多酚粗提物。

1.5 总酚含量及提取率的测定[13]

用没食子酸丙酯配制成0.5 mg/mL的对照品标准溶液。

表1 标准曲线测定实验组Tab.1 Standard solution curve

取上述浸提液5.0 mL加入25 mL容量瓶中，自加入酒石酸铁溶液开始按绘制标准曲线的操作步骤操作。以蒸馏水代替试液加入同样试剂作空白，每个样品做三次平行实验，结果取平均值。按公式计算海带多酚的提取率。

式中，S-海带多酚浓度（mg/mL）；

V-提取液体积（mL）；

M-鲜海带质量（mg）；

C-鲜海带含水率（%）。

1.5 海带多酚抗菌活性测定

制备浓度大约在105～106 cfu/mL菌悬液，用移液枪吸取100 μL菌悬液，放在已标明样品号的无菌平板上（真菌外加1mL浓度为200 μg/mL的多酚粗提液），每种菌制备3个平板，立即倒入融化后冷却至50℃左右的培养基约15 mL，随即在平面上快速而轻巧地晃动平皿，使菌悬液（样液）和培养基混合均匀后平置，待其冷却。采用平板生长抑制法进行多酚抑菌活性测定。即在洁净工作台内，将经过紫外线照射杀菌20 min后的移液枪装上特制枪头，在已冷却的营养琼脂平板上均匀的打上5个直径为3 mm的光滑小孔，其中1个小孔加30 μL无菌蒸馏水作为对照，其余4个小孔分别加30 μL过滤除菌后的待测液。加完样液后平板静置放置10 min，以保证待测液分散均匀。将已经加样的含菌平板倒置放入37℃（真菌28℃）的恒温培养箱中，培养12～24 h后观察抑菌结果。

1.6 抗菌活性数据分析

细菌测量透明圈的直径，取所测4孔抑菌圈直径的平均值；真菌则观察加样平板与未加样对照组菌落或菌丝生长状况的差别。以大于空白的抑菌圈直径所对应的多酚浓度（μg/mL）为最低抑菌浓度（MIC），并对所得结果进行统计学分析，所有数据均采用平均值±标准差。

图1 多酚标准曲线Fig.1 Polyphenols standard curve

2 结果与讨论

2.1 提取方法比较

从图2可以看出，复合处理较无处理和单一方式处理，多酚的浸出率要高，且超声波→微波复合处理效果最好。因为先通过超声波的机械粉碎和空化效应等作用，可使物质分子运动的频率和速度增大，溶剂的穿透力增强，组织内部或胶体里的有效成分溶出速度和溶出数量得到提高[14-15]，再辅以微波的生理、物理效应使极性分子随微波频率摆动并产生热量，使体系更加分散，有利于物质的溶出。超声波处理过后的样品更适宜于微波发挥其功效，使原料内部温度在微波辐射下得以全面、快速、均匀升高，从而加快溶剂对多酚的提取过程，大大提高提取的效率。此复合提取法克服了传统方法的缺点，具有操作简便，经济、省时的优点，所以在相同的时间内大大提高了多酚的浸出率[12]。因此，最佳前处理方式选择超声波→微波。

2.2 单因素实验

2.2.1 浸提时间对多酚浸出率的影响

采用超声波→微波前处理方式，固定浸提温度60℃，乙醇浓度80%，料液比（匀浆:乙醇，g/mL）1:4，浸提2次的提取条件，观察不同提取时间对海带多酚提取率的影响，结果如图3。

从图3可以看出，浸提时间为4 h时，浸提率最高并且比较稳定，而浸提时间超过4 h后，海带多酚浸提率出现不稳定并呈下降趋势，这可能是浸提时间太长多酚被氧化或降解的缘故，因此，正交实验中浸提时间范围应选3.5～5 h。

图2 前处理方式对多酚浸出率的影响Fig.2 Polyphenols extraction ration of different methods

图3 时间对多酚浸出率的影响Fig.3 Time on polyphenols extraction rate

2.2.2 浸提温度对多酚浸出率的影响

采用超声波→微波前处理方式，固定提取时间4 h，乙醇浓度80%，料液比（匀浆:乙醇，g/mL）1:4，浸提2次的提取条件，观察不同浸提温度对海带多酚提取率的影响，结果如图4。

从图4可以看出，随着温度的升高，多酚的浸出率呈上升趋势，在20～40℃之间时浸出率基本上没有变化，40～80℃时浸出率明显升高。这是由于温度升高，分子运动加速，氢键更易断裂，多酚的渗透、溶解、扩散速度也加快，因而酚类物质更易于从原料中溶出。而超过80℃时，浸出率反而降低，可能由于高温下海带多酚类物质易于发生氧化或降解反应。因此，初步确定60～90℃为正交实验的提取温度范围。

2.2.3 乙醇浓度对多酚浸出率的影响

采用超声波→微波前处理方式，固定提取时间4 h，浸提温度60℃，料液比（匀浆:乙醇，g/mL）1:4，浸提2次的提取条件，观察不同乙醇浓度对海带多酚提取率的影响，结果如图5。

从图5可以看出，匀浆中加入乙醇后，随着乙醇浓度的升高，多酚的浸出率有上升的趋势，但当乙醇浓度超过80%后，多酚浸出率呈下降趋势。原因可能是低浓度的乙醇含水量过高，促进了海带中的许多粘性物质和外来水分互溶形成胶团，从而影响浸出率，而高浓度的乙醇挥发性较大，使提取液极性降低，也会影响浸出率。因此，正交实验乙醇浓度应在75%～90%。

2.2.4 料液比对多酚浸出率的影响

采用超声波→微波前处理方式，固定提取时间4 h，浸提温度60℃，乙醇浓度80%，浸提2次的提取条件，观察不同料液比（匀浆:乙醇，g/mL）对海带多酚提取率的影响，结果如图6。

料液比（匀浆：乙醇，g/mL）是影响多酚浸出率的重要因素之一，适当的料液比不仅能使原料中的多酚物质得到充分提取，而且可减少溶剂的浪费和节省提取成本[16]。从图6可以看出，随着料液比的增大，多酚的浸出率呈上升趋势但趋势并不明显。且过大的料液比也使得乙醇的用量增加，成本上升，对乙醇的回收不利。因此，初步确定正交实验的料液比（匀浆:乙醇，g/mL）在1:5～1:8之间。

2.2.5 浸提次数对多酚浸出率的影响

采用超声波→微波前处理方式，固定提取时间4 h，浸提温度60℃，乙醇浓度80%，料液比（匀浆:乙醇，g/mL）1:7的提取条件，观察不同浸提次数对海带多酚提取率的影响，结果如图7。

从图7可以看出，提取3次时多酚含量最高，随着提取次数的增加，浸出率反而下降，原因可能是由于提取次数过多导致多酚溶出量提高的同时，也将大分子物质如糖、蛋白质等提取出来，多酚与这些大分子物质形成复合物，同时部分多酚也会发生氧化损耗，降低多酚浸出率。所以，正交试验选择提取次数为1～4次。

2.3 提取条件优化

在单因素实验的基础上，选用L16（45）设计表格进行正交实验，因素水平见表2。

图4 温度对多酚浸出率的影响Fig.4 Temperature on on polyphenols extraction rate

图5 乙醇浓度对多酚浸出率的影响Fig.5 Ethanol concentration on polyphenols extraction rate

图6 料液比对多酚浸出率的影响Fig.6 Solid-liquid ratio on polyphenols extraction rate

图7 提取次数对多酚浸出率的影响Fig.7 Extraction times on polyphenols extraction rate

表2 因素水平表Tab.2 Table of factors and levels

表3 正交实验结果Tab.3 Results of orthogonal experiments

通过极差分析可知，各因素对多酚浸出率影响的顺序是：料液比E＞乙醇浓度C＞浸提温度B＞浸提次数D＞浸提时间A，从表中数据看，最佳工艺条件应是E4C4B2D4A2，在此条件下，多酚的浸出率为2.20%。但是，比较相邻两个水平之间的斜率E3、C3、D2较高，另外，从经济角度考虑，采用E3、C3、D2可以减少工序并降低提取成本，且在E3C3B2D2A2条件下多酚的浸出率为2.08%，与上述浸出率2.20%无明显差异。因此，得出多酚提取的最佳条件是：E3C3B2D2A2，即料液比（匀浆:乙醇，g/mL）1:7，乙醇浓度85%，浸提温度70℃，浸提次数2次，浸提时间4 h。

2.4 抗菌试验结果

2.4.1 抗细菌试验结果

抑菌实验结果表明，KP粗提液在一定的浓度下，对供试的2种革兰氏阳性菌和5种革兰氏阴性菌都有一定程度的抑制活性，但是不同的微生物对其敏感性不同，多酚对革兰氏阴性细菌的抑制效果较明显，又以对大肠杆菌、绿脓杆菌的抑制效果更佳。而且所有细菌对多酚的量效关系均呈剂量依赖型，因而可以开发成一种高效广谱抗菌剂。

图8 不同浓度的粗提液对细菌的抑制作用Fig.8 Antibacterial effect of different concentration extraction

同时，从图8中也可以看出，随着多酚浓度的降低，抑菌效果也明显降低，当浓度为40 μg/mL时，KP粗提液对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和普通变形杆菌的抑菌活性已经不明显。当浓度降至10 μg/mL时，已无抑菌圈，KP粗提液对大多数供试菌种基本失去抑菌活性。因而可以认为KP粗提液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾志贺菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌7种供试菌的MIC 分别为40、10、10、40、10、40 和 40 μg/mL。在此浓度下，它们的抑菌圈直径分别是：3.2、3.5、3.1、3.5、3.2、7.0和 3.5 mm。

2.4.2 抗真菌试验结果

表4中结果显示，供试的KP对青霉菌菌丝生长的抑制活性最高，其次是白色念珠菌，对黄曲霉、灰霉菌丝生长的抑制活性较小。而且供试KP对青霉、白色念珠菌真菌生长的抑制主要是抑制菌丝和菌落的生长速度，表现为菌落直径比对照减小。但对黄曲霉、灰霉菌的抑制主要表现为菌丝明显比对照稀薄，而菌落直径并未明显减小。海带粗提物抑制真菌菌丝生长的机理尚有待明确。

表4 粗提液对真菌的抑制作用Tab.4 Inhibition fungi of algae extraction

3 结论

通过单因素实验和正交实验确定了超声波、微波复合提取海带多酚类物质的最佳提取工艺条件，即料液比（匀浆:乙醇，g/mL）1:7，乙醇浓度85%，浸提温度70℃，浸提次数2次，浸提时间4 h。在该条件下总多酚的浸出率可以达到2.08%。

海带多酚粗提液具有广谱抗微生物性能，对供试的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有一定程度的抑制活性，对真菌如青霉、白色念珠菌亦有抑制作用。所有细菌对多酚的量效关系均呈剂量依赖型。另外，多酚对革兰氏阴性细菌的抑制效果较明显，又以对大肠杆菌、绿脓杆菌的抑制效果更佳。粗提液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾志贺菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌7种供试菌的MIC分别为40、10、10、40、10、40和40 μg/mL。将超声波、微波技术应用于海带中多酚类活性物质的提取，可获得较好的效果，具有广阔的应用前景。

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