灌木柳无性系茎段组织培养快速繁殖试验

陈智敏，张 敏，王保松，黄利斌，施士争，张 珏

（1.河南省水利勘测设计研究有限公司，河南 郑州 450000；2.江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153）

灌木柳无性系茎段组织培养快速繁殖试验

陈智敏1，张 敏2*，王保松2，黄利斌2，施士争2，张 珏2

（1.河南省水利勘测设计研究有限公司，河南 郑州 450000；2.江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153）

以灌木柳无性系2345、2367的嫩枝为外植体，进行组织培养快速繁殖技术的研究。结果表明：2种灌木柳芽苗诱导最适培养基为WPM＋6-BA 0.4 mg／L＋GA30.1 mg／L＋CH 500 mg／L＋活性炭1 g／L＋蔗糖30 g／L＋卡拉胶6.3 g／L；最适增殖及生根培养基为WPM＋6-BA 0.6 mg／L＋NAA 0.05 mg／L＋CH 500 mg／L＋活性炭1 g／L＋蔗糖30 g／L＋卡拉胶6.3 g／L。将健壮生根苗移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1∶1，成活率大于98%。

灌木柳；组织培养；茎段

柳树是杨柳科（Salicaceae）柳属（Salix）植物的通称，全世界共有526种，主要分布在北半球温带地区。中国有257种，120个变种和33个变型，其中绝大多数为灌木柳。灌木柳分布广、生长快、产量高、热值高、抗逆性强、易于更新以及木材用途广泛，是防护林、水土保持林、风景林及用材林的重要组成树种，也是备受关注的能源树种［1－2］。柳树种间及其杂交子代的家系、无性系间都存在着非常丰富的遗传变异，因此进行速生、高生物量、耐盐碱、抗病虫害良种选育具有丰富的遗传基础［3］。

灌木柳的常规繁殖以扦插为主，不同种柳树插条生根能力除了由遗传因素决定以外，还受到插条年龄、粗度、木质化程度、有无生长叶或活动芽等指标的影响，特别是繁殖时间有严格的季节限制。灌木柳还可用播种育苗进行繁殖，但其种子较小，宜随采随播，且不能保持良种原有的优良特性。组织培养技术是目前林业生物技术的主要内容之一，其主要用途是林木的大规模繁殖和分子育种［4］。灌木柳高效组织培养再生体系的成功建立，对其生物学研究、遗传改良和多目标分子育种等工作的开展均具有重要意义。

本试验以2种灌木柳无性系的茎段为初始外植体，通过分析其离体再生的影响因素，探讨最佳组织培养条件，建立高效离体再生体系，为柳树遗传转化研究和分子育种的离体诱导奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用材料为江苏省林业科学研究院遗传育种研究所杂交培育的2个高生物量灌木柳无性系2345、2367，其来源见表1。

表1 2种灌木柳无性系及其来源

取生长健壮、无病虫害的1～2年生柳树枝条，摘除老叶，置于室温下水培7 d，每天换水1次，以新长出的嫩茎作为外植体。

1.2 方法

1.2.1 材料处理 将新生嫩茎去叶，剪成长4 cm的小段，用洗衣粉水浸泡20 min，自来水冲洗5次，备用。

1.2.2 接种 将冲洗干净的外植体转到超净工作台上，用70%（体积百分数）乙醇和0.1%（质量百分数）HgCl2作为消毒剂，酒精处理时间相同都为40 s，升汞的处理时间分别为2.5，3，4，5 min及6 min，再用无菌水冲洗5～7次。

将消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口部位，留1～2 cm带芽茎段接种在含有诱导培养基的培养瓶中。每处理接种20瓶，每瓶5个外植体。14 d后观察其污染及成活情况，并统计污染率。

1.2.3 培养基和培养条件 诱导培养基：以WPM为基本培养基，其中均添加CH 500 mg／L，活性炭1 g／L，蔗糖30 g／L和卡拉胶6.3 g／L，在GA3质量浓度相同的情况下，添加不同质量浓度的6-BA，在6-BA质量浓度相同的情况下添加不同质量浓度的GA3，探索适合灌木柳丛芽诱导的激素质量浓度筛选出合适的培养基配方。

选取相同条件下生长良好的水培得到的嫩茎作为外植体，用筛选出的适宜消毒时间进行消毒，消毒后将其切成长1～2 cm的茎段接种到添加不同质量浓度激素的WPM培养基中（培养基中激素配比见表3），将其置于光照度为1 500～2 000 lx，每日光照时间为16 h，温度（26±2）℃，相对湿度65%～75%的条件培养；重复3次。培养15 d后统计萌芽率。

增殖培养基：将诱导产生的试管苗，剪切成1.5～2.0 cm带有1～2个腋芽的节段，转接于以WPM为基本培养基，添加不同质量浓度激素的培养基中进行继代培养（培养基中激素配比见表4）。培养环境同初代培养，培养20 d后统计增殖系数。

1.2.4 炼苗 将增殖培养获得的健壮再生植株开瓶培养2 d进行炼苗，取出试管苗，洗净，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中进行炼苗，其中泥炭与黄心土的体积比为1∶1。

1.2.5 结果评测指标 材料接种后，定期观察记录生长情况，主要统计指标及计算公式如下［5］：

死亡率／%＝死亡的外植体数／接种的外植体总数×100；

污染率／%＝污染的外植体数／接种的外植体总数×100；

诱导率／%＝萌发出叶片的外植体数／接种的外植体总数×100；

增殖系数／%＝增殖后的芽苗数／接种的外植体总数×100；

生根率／%＝生根的外植体数／接种的外植体总数×100；

移栽成活率%＝移栽成活的植株数／移栽的植株总数×100。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对诱导培养的影响

由结果（见表2）可知，不同灭菌处理对2种灌木柳无性系的死亡率和污染率影响不尽相同。使用质量分数为0.1%的HgCl2消毒5 min，2个品种的成活率均最高，分别为98%和99%，灭菌效果明显。随着HgCl2消毒时间的延长，污染率均降低，但对外植体造成了伤害，致使死亡率升高。综合分析死亡率、污染率的测定结果，2种试验材料均以体积分数为75%的乙醇40 s结合质量分数为0.1%的HgCl2处理5 min为最佳消毒方案。

表2 不同方式的灭菌效果

2.2 不同激素质量浓度配比对诱导培养的影响

灌木柳2345及2367均在接种后7 d即开始萌芽，从结果（见表3）可以看出，2个品种在各个培养基间的差异均极显著，在GA3质量浓度相同的情况下，诱导率随着6-BA质量浓度的增加均呈现先高后低的趋势，在6-BA质量浓度为0.4 mg／L时，诱导率达96%和95%。在6-BA质量浓度相同的情况下，诱导率随着GA3质量浓度的增加而增加，且在各个培养基中均有根产生。

2.3 继代与增殖培养

组织培养苗的增殖指在无性条件下芽的生长与分化，最后繁殖成完整植株［6－7］。本研究中，2个品种在不同激素组合间的差异均极显著。生长调节物质配比对茎芽增殖的影响见表4，在GA3质量浓度相同时，随着6-BA质量浓度的增加，增殖系数呈现先降后增的趋势。在6-BA质量浓度相同时，随着NAA质量浓度的增大增殖系数逐渐降低。在各个培养基中均有大量根系产生，其中在培养基WPM＋6-BA 0.6 mg／L＋NAA 0.05 mg／L＋CH 500 mg／L＋活性炭1 g／L＋蔗糖30 g／L＋卡拉胶中6.3 g／L的增殖系数可达4～6倍，生根率高达100%。

表3不同激素组合对灌木柳带芽茎段萌发的影响

2.4 驯化移栽

将试管苗株高6～8 cm、根系发达，根长且叶片展开的再生植株开瓶培养2 d进行炼苗，取出试管苗，洗净，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的体积比为1∶1，然后浇透水，用塑料薄膜覆盖容器口，保持温度24～28℃，相对湿度75%～85%，适当遮荫，培养15～20 d至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得灌木柳苗木，成活率98%以上（见图1）。

3 结论与讨论

酒精对细胞具有较强的穿透性和杀伤性，容易使被处理的材料受到损伤，因此把握好消毒时间是保持材料活性的关键。以灌木柳茎段为外植体进行组织培养时，适宜的消毒条件为以70%（体积分数）乙醇40 s＋0.1%（质量百分数）升汞5 min。

表4不同激素组合对灌木柳带芽茎段增殖的影响

图1 灌木柳离体培养与植株再生

2种灌木柳芽苗诱导最适培养基为WPM基本培养基＋6-BA 0.4 mg／L＋GA30.1 mg／L＋CH 500 mg／L＋活性炭1 g／L＋蔗糖30 g／L＋卡拉胶6.3 g／L。在选择茎段培养基时，激素搭配应以外植体不愈伤化为基本原则，使其直接发育长成植株。因为若经过愈伤组织分化，植株容易发生变异，所以倡导以不含生长素的培养基进行茎尖分生组织的诱导［8］。

本研究中最适增殖培养基为WPM基本培养基＋6-BA 0.6 mg／L＋NAA 0.05 mg／L＋CH 500 mg／L＋活性炭1 g／L＋蔗糖30 g／L＋卡拉胶6.3 g／L。在该培养基中同时可获得健壮的生根苗，无需专门的壮苗培养和生根培养阶段。活性炭可促进组织培养苗健壮生长，有利于根的生成［9］。组织培养苗根系有避光生长的特性，活性炭可提供暗环境，为培养基中光敏性生长素的积累提供合适的环境［10～11］。由于根顶端能产生利于根生长的IAA，但IAA易受光氧化而被破坏，因此活性炭的作用正是通过减弱光照保护了IAA，从而间接地促进了根的生长。本研究也发现如果不加活性炭植株会变弱，且根系减少。

近些年，生物技术的不断发展与应用为柳树遗传育种开创了新的途径。柳树组织培养的难易与基因型、培养基的类型和光照温度等培养条件密切相关［12］。如何继续提高芽的增殖系数和试管苗的成苗速度，建立高效的遗传转化体系，还有待于进一步研究。

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S792.12；Q943.1

A

10.3969／j.issn.1001－7380.2014.05.007

1001－7380（2014）05－0027－03

2014-07-07

国家自然科学基金“NaCl胁迫下一氧化氮调控灌木柳液泡膜H＋－ATPase的分子机制”（31300515）；江苏省自然科学基金“柳树H＋－ATPase响应NaCl胁迫的分子机制”（BK2011872）

陈智敏（1987－），女，河南商丘人，硕士，主要从事水环境植物配置研究与设计。

*通信作者：张 敏（1980－），女，内蒙古人，副研究员，博士，主要从事植物逆境生物学及林木花卉良种繁育研究。