不同环境下二氧化氯消毒剂的消毒效果及其稳定性研究

张庆华,姬素霞,胡金花,闫丽,张鹏,胡建和,徐彦召

（1.河南科技学院,河南新乡453003；2.新乡康大消毒剂有限公司,河南新乡453000）

不同环境下二氧化氯消毒剂的消毒效果及其稳定性研究

张庆华1,姬素霞1,胡金花2,闫丽2,张鹏2,胡建和1,徐彦召1

（1.河南科技学院,河南新乡453003；2.新乡康大消毒剂有限公司,河南新乡453000）

为了研究不同环境下二氧化氯的消毒效果及其稳定性,试验以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌为测试菌株,采用菌悬液定量杀菌试验、压缩雾化法和平板计数的方法,对二氧化氯的杀菌效果进行试验.结果表明：在菌液密度为5×106CFU/mL的条件下,90 mg/L的二氧化氯作用5 min,即可对测试菌株达到100%的杀灭效果.不同的pH值、温度及不同浓度有机物存在的条件下,二氧化氯同样具有极强的消毒效果.雾化的二氧化氯对空气自然菌及雾化菌液气溶胶的杀灭效果同样可以达到100%.试验表明二氧化氯作为一种高效、稳定的广谱消毒剂具有良好的杀菌效果.

二氧化氯；消毒剂；消毒效果；稳定性

二氧化氯由于其广谱、高效的杀菌能力,被公认是当今国际上含氯类消毒剂产品中唯一高效的消毒杀菌剂[1-2].在较低的质量浓度下,二氧化氯短时间内即可杀灭绝大多数的微生物,包括细菌芽孢、繁殖体、分歧杆菌、真菌和病毒等[3].二氧化氯是通过对细菌细胞壁较强的吸附穿透能力而进入细菌细胞内,其极强的氧化能力可以有效的氧化细胞内含有巯基的生物酶,使其失去生物活性,并可以迅速的抑制细胞内蛋白的代谢、合成,从而引起微生物的死亡[4].不仅可以杀灭细菌,二氧化氯还具有除臭、保鲜、抗霉、防腐、漂白及氯化等多方面的作用,因此被广泛的应用于多个领域[5-7].研究表明,二氧化氯对高等生物的体细胞无致畸、致癌、致突变作用,且与有机物的氧化降解产物,被证明对生物体十分安全,无毒副作用[8].因此二氧化氯也是被世界卫生组织（WHO）定义为A1级的安全消毒剂.由于临床使用环境的多样性以及人们对其杀菌效果认识的不确切,二氧化氯在实际使用过程中存在着不合理使用的现象.本文就不同环境下二氧化氯对常见致病菌的最低有效杀菌浓度及其稳定性进行了研究,希望对二氧化氯的合理使用提供科学的参考依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,ATCC 8099菌株；大肠杆菌（Escherichia coli）,ATCC 6538菌株；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,ATCC 9372菌株；白色念珠菌（Monilia albican）,ATCC 10231菌株.以上菌株均购自南京便珍生物科技有限公司.胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖、葡萄糖、PBS、胎牛血清均购自Solarbio公司.二氧化氯消毒剂（有效氯质量分数为4.5%）由新乡康大消毒剂公司提供.

1.2 试验方法

1.2.1 定性杀菌试验参照《消毒技术规范》（2008）,将制备好的菌液进行活菌计数,然后用0.03 mol/L磷酸盐缓冲液稀释为菌落密度5×105～5×106CFU/mL的菌液.10支中号试管排列于试管架上,依次编号1-10.每管添加无菌蒸馏水2.5mL,放20℃水浴中.于第1管加消毒液原液2.5mL,混匀后,由第1管取2.5mL至第2管,混匀后再从第2管吸2.5 mL至第3管,以此类推,直至第9管,混匀后取出2.5 mL弃去,第10管不加消毒药液作为阳性对照.以每0.5 min加一管的速度加菌液2.5 mL于每支试管内,混匀,第9管不加菌液为阴性对照.加菌液后的5、10、15、30、60 min时,每管各取0.5 mL加入含足量中和剂（质量浓度为5‰的硫代硫酸钠）的4.5 mL液体培养基中,摇匀,中和10 min,再取出0.5 mL加入4.5 mL液体培养基内.将接种细菌的培养基管,置37℃培养48 h,若发生混浊即表示有细菌生长.必要时,可移植到固体培养基上,观察菌落形态,或进行涂片染色镜检,以判断生长的是否为试验菌,以排除污染.若肉汤不变混浊,应继续培养至第7天,若仍不混浊方可判为无菌生长.

1.2.2 定量杀菌试验将制备的菌液进行活菌计数,然后用0.03 mol/L的磷酸盐缓冲液稀释成菌落密度为106～107CFU/mL的试验菌液.吸取0.5 mL消毒剂溶液滴加于4.5 mL不同浓度的消毒剂溶液内.以0.03 mol/L磷酸盐缓冲液代替消毒液,同时进行上述各步骤,作为对照组.置20℃水浴中作用5 min.立即吸取上述菌药混合液1.0 mL,加入9.0 mL中和液中混匀.中和10 min后吸取0.2 mL菌药混合液进行涂板计数,37℃培养24 h后计数.试验重复3次,结果取平均值.

1.2.3 pH值对二氧化氯杀菌效果的影响新鲜配制90 mg/L的二氧化氯消毒剂4.5 mL盛于中号试管并置于20℃恒温水浴锅内,分别调整pH值为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0.将培养至对数生长期的菌悬液分别稀释至菌落浓度为106CFU/mL,每支试管添加稀释后菌液0.5 mL.同时设加菌不用消毒剂的阴性对照、不加菌液不用消毒剂的阳性对照.于使用消毒剂后10 min取水样1.0 mL,加入到9.0 mL质量浓度为5‰的硫代硫酸钠溶液中混匀,中和10 min后吸取0.2 mL菌药混合液进行涂板计数,37℃培养24 h后计数.试验重复3次,结果取平均值.

1.2.4 温度对二氧化氯杀菌效果的影响新鲜配制的90 mg/L二氧化氯消毒剂4.5 mL盛于5支中号试管分别置于恒温水浴锅内,分别调整水浴锅温度为0℃、10℃、20℃、30℃、40℃.1.2.3所述稀释的菌液,每支试管添加0.5 mL.同时设加菌不用消毒剂的阴性对照、不加菌液不用消毒剂的空白对照.于使用消毒剂后10 min取水样1.0 mL,加入到9.0 mL质量浓度为5‰的硫代硫酸钠溶液中混匀,中和10 min后吸取0.2 mL菌药混合液进行涂板计数,37℃培养24 h后计数.试验重复3次,结果取平均值.

1.2.5 有机物对二氧化氯杀菌效果的影响蒸馏水分别配制胎牛血清体积分数为5%、10%、15%、20%的溶液,并添加固体二氧化氯至质量浓度为90 mg/L消毒剂溶液.取4支无菌中号试管,每管添加4.5 mL不同有机物浓度的消毒剂溶液,于恒温锅中20℃水浴.取1.2.3所述稀释浓度的菌液,每支试管添加0.5 mL.同时设加菌不用消毒剂的阴性对照、不加菌液不用消毒剂的空白对照.于使用消毒剂后10 min取水样1.0 mL,加入到9.0 mL质量浓度为5‰的硫代硫酸钠溶液中混匀,中和10 min后吸取0.2 mL菌药混合液进行涂板计数,37℃培养24 h后计数.试验重复3次,结果取平均值.

1.2.6 二氧化氯对空气中细菌的消毒试验于两个相同的空间,一作试验（喷洒或蒸发消毒剂）,一作对照（以喷洒空气或水代替消毒剂）,同时用同法采样、培养.记录试验时温度和相对湿度.采用平板沉降法采样.采样方法、位置、次数、间隔时间、采样时间等,试验前后、试验组和对照组均完全一致.空气消毒杀菌率Pt按式（1）计算.

式（1）中Nt=（V0－Vt）/V0.Nt为空气细菌自始至t时的自然消亡（沉降和死亡）率.V0和V0,分别为对照组及试验组处理前空气含菌量.Vt和Vt,分别为对照组及试验组处理后空气含菌量.

将测试的4种细菌菌液用压缩式雾化器喷成气溶胶,雾化颗粒在10μm以下,空气含菌量5×104CFU/m3左右.雾化喷菌10 min后开始采样,检测处理前空气细菌含量,立即对试验空间进行空气消毒,同时设空气或水对照.然后同样采样培养.记录试验时的温湿度.同上统计分析.

2 结果与分析

2.1 二氧化氯定性、定量杀菌结果

二氧化氯的最低有效杀菌浓度与时间的能效关系及定量杀菌数据见表1和表2.

表1 二氧化氯定性杀菌试验Tab.1 The qualitative germicidal test of chlorine dioxide

表2 二氧化氯对4种测试细菌定量杀菌试验Tab.2 Quantitative germicidal rest of chlorine dioxide to the tested strains%

由表1、表2可知,作用时间为5 min时,二氧化氯对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的最低有效杀菌质量浓度分别为90 mg/L、180 mg/L、90 mg/L、90 mg/L、180 mg/L.处理时间大于等于30 min时,二氧化氯即可达到最大的杀灭效果.

2.2 不同pH值、温度和血清体积分数对二氧化氯消毒效果的影响

不同环境条件下,二氧化氯的杀菌效果见表3、表4、表5.

表3 不同pH值下二氧化氯的消毒效果Tab.3 Disinfection effect of chlorine dioxide in different pHCFU/mL

表4 不同温度下二氧化氯消毒效果Tab.4 Disinfection effect of chlorine dioxide in different temperatureCFU/mL

表5 不同血清体积分数下二氧化氯消毒效果Tab.5 Disinfection effect of chlorine dioxide in different concentrate of serumCFU/mL

试验结果表明,pH值在2～10的范围内,90 mg/L的二氧化氯对测试细菌的细菌杀菌效果均达到100%（表3）.温度在0～40℃的范围内,90 mg/L的二氧化氯对测试细菌的细菌杀菌效果均达到100%（表4）.在血清体积分数为5%～20%的范围内,90 mg/L的二氧化氯对测试细菌的细菌杀菌效果均达到100%.即pH值、温度和有机物对二氧化氯的消毒效果几乎无影响（表5）.

2.3 二氧化氯对空气消毒的杀菌效果

二氧化氯对空气中自然菌及特定细菌气溶胶的杀菌效果见表6和表7.

表6 二氧化氯对空气自然菌消毒的杀菌率Tab.6 Sterilizing rate of chlorine dioxide to natural air

表7 二氧化氯对空气中特定细菌的杀菌效果Tab.7 Disinfection of chlorine dioxide to aerosol of tested bacteria

由表6可知,空气自然菌的喷水对照组和消毒前菌落数分别为56和54.对空气中雾化喷洒浓度90 mg/L的二氧化对空气自然菌的杀菌率为96.30%.由表7可知,采用自然沉降法采集雾化后空气中的菌落数目,雾化90 mg/L的二氧化氯消毒,作用20 min后,二氧化氯对4种测试菌株的杀菌率均为100%.

3 结论与讨论

从对4种常见致病菌的杀灭效果可以看出：当消毒剂作用时间为20 min时,11.25 mg/L的二氧化氯即可杀灭水体中90%的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌,全部杀灭细菌的质量浓度在45～90 mg/L.不同pH值、温度及血清不同体积分数对二氧化氯的杀菌效果没有影响.当室温20℃、消毒剂作用时间为20 min时,90 mg/L的二氧化氯雾化20 min后对空气中自然菌的杀菌率达到96.30%,对空气中特定大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌气溶胶的杀菌率均为100%.黄晓波等研究表明,给药量在117 mg/kg（体质量）条件下,二氧化氯对大鼠的体质量、血常规及血液生物化学等指标无异常变化,与阴性对照组比较均无显著差异,病理检查亦无显著差异[9].李淑琴等在兔多次完整皮肤刺激试验中,稳定性二氧化氯在含量为1 996.5 mg/L的质量浓度下多次接触动物完整皮肤末引起动物皮肤刺激反应,属于无刺激性物质；在亚急性毒性试验中,动物经过30 d喂养后,试验各剂量组实验动物体重增加正常,生长发育良好,与正常对照组相比差异无显著性[10].综合本试验结果表明,二氧化氯消毒剂作为一种广谱、高效、安全的杀毒剂,在临床使用过程中不易受环境因素影响,对动物体刺激性较小具有良好的生物安全性.以90 mg/L为二氧化氯的正常使用质量浓度,即可对水体、墙面及空气中的细菌起到很好的杀菌效果.

[1]Gagnon G,Rand J,O’Leary K,et al.Disinfectant efficacy of chlorite and chlorine dioxide in drinking water biofilms[J].Water Research,2005,39（9）：1809-1817.

[2]Lim M Y,Kim J M,Ko G.Disinfection kinetics of murine norovirus using chlorine and chlorine dioxide[J].Water research,2010,44（10）：3243-3251.

[3]Lee S Y,Dancer G I,Chang S S,et al.Efficacy of chlorine dioxide gas against Alicyclobacillus acidoterrestris spores on apple surfaces[J].International journal of food microbiology,2006,108（3）：364-368.

[4]Jang A,Szabo J,Hosni A A,et al.Measurement of chlorine dioxide penetration in dairy process pipe biofilms during disinfection[J]. Applied microbiology and biotechnology,2006,72（2）：368-376.

[5]程鹏,王岸明.二氧化氯、臭氧是杀菌、消毒、漂白的最佳选择[J].环境科学与技术,2001（增刊1）：64-65.

[6]牛瑞雪,惠伟,李彩香,等.二氧化氯对“秦美”猕猴桃保鲜及贮藏品质的影响[J].食品工业科技,2009（1）：289-292.

[7]张春辉,朱琨,裴元生,等.二氧化氯对印染废水脱色研究[J].环境科学学报,2001（增刊1）：110-113.

[8]Zhang Z,Mccann C,Stout J E,et al.Safety and efficacy of chlorine dioxide for Legionella control in a hospital water system[J].Safety, 2007,28（8）：1009-1012.

[9]黄晓波,岳木生,彭明军,等.二氧化氯消毒剂的亚急性毒性试验[J].中国消毒学杂志,2007,24（3）：236-238.

[10]李淑琴,边林秀,陈俊文.稳定性二氧化氯消毒剂的皮肤刺激和亚急性毒性试验研究[J].山西医科大学学报,2006,37（8）：825-828.

The research of disinfectant effect and stabilization of chlorine dioxide antiseptic in different environments

Zhang Qinghua1,Ji Suxia1,Hu Jinhua2,Yan Li2,Zhang Peng2,Hu Jianhe1,Xu Yanzhao1
（1.Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China；2.Xinxiang Kangda disinfectant Co.,Ltd.,Xinxiang 453003,China）

To research the disinfetant effect and stabilization of chlorine dioxide in different environments,the antibacterial activity of chlorine dioxide to Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis and Manidia albican was tested by quantitative germicidal test,compression atomizing effect and plate counting method.The results showed that chlorine dioxide at 90 mg/L could kill all the bacteria in 5 min.Chlorine dioxide exhibits widely antiseptic properties in multi-environment,despite of the pH value,temperature and organic matter.Chlorine dioxide in gaseous also had the forceful sterilizing effect to the normal air and the theaerosol of bacterial suspension.It indicated that chlorine dioxide with the quality of efficient and stable have the excellent antibacterial activity as an disinfectant.

chlorine dioxide；disinfectant；efficacy of disinfection；stabilization

TP386

A

1008-7516（2014）04-0062-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.04.015

2014-05-20

张庆华（1988-）,男,河南开封人,硕士研究生.主要从事动物微生物学研究.

徐彦召（1984-）,男,河南许昌人,讲师.主要从事动物微生物学、免疫学研究.

（责任编辑：卢奇）