丹参多酚酸盐对心肌细胞TGF-β信号通路的影响

费爱华，陈 淼，潘曙明

(上海交通大学医学院附属新华医院，上海200092)

心力衰竭是各种病因导致心肌损害的最终归宿，是急诊的常见病和多发病，对人类健康产生严重危害。在心力衰竭发生发展过程中，一个非常重要的病理生理因素是心脏重构。而在心肌重构过程中，转化生长因子β(TGF－β)发挥至关重要的作用。丹参作为活血化瘀的传统中药之一，在临床上被广泛应用于心脏病、脑动脉硬化、老年性痴呆和糖尿病性微血管疾病等的防治[1]。丹参的主要作用成分为水溶性酚酸类物质，其主要的活性成分是丹酚酸B。丹参多酚酸盐可能通过其抗氧化作用，抑制TGF－β信号通路的活化，从而减轻心肌重构。本研究在H2O2诱导培养的氧化损伤大鼠心肌细胞模型上，检测丹参多酚酸盐处理前后心肌细胞TGF－β通路相关蛋白的表达情况，为进一步研究丹参多酚酸盐抗氧化损伤防治心肌细胞重构的作用提供理论依据，为心力衰竭的预防提供新思路。

1 实验资料

1.1 原代心肌细胞的培养 选用1～3 d龄SD大鼠，用2%碘酊和75%乙醇按照顺序消毒胸部、腹部皮肤，用无菌手术包中的剪子沿剑突下胸骨中线剪开胸骨至锁骨，用弯眼科钳将暴露良好的心脏夹出，放置DMEM培养液中。将夹出的心脏放在超净工作台内，心室剪成两瓣，心肌反复3次洗涤后移入青霉素瓶中，加入D－Hanks液1 mL，用弯眼钳将心尖部剪成约1 mm3大小，然后将剪碎后的心肌组织用吸管移入带刻度的离心管(5 mL)，弃上清后再洗涤1次后加入25%胰蛋白酶溶液5 mL，放置在37℃水浴中消化5 min，在消化液加入DMEM培养液稀释，用吸管吸取细胞消化液至加入浓度为10%左右的新生小牛血清的培养瓶中，终止消化;经过12次左右的反复消化，可将组织基本消化完。将细胞液收集离心，接种于培养瓶中。在37℃、5%CO2培养箱中差速贴壁分离法将培养瓶中的单细胞悬液孵育1.5～2h。将未贴壁的心肌细胞悬液吸出，将细胞混悬于5－溴脱氧尿嘧啶终浓度为0.1 mmol/L的含20%胎牛血清的DMEM培养液中，细胞计数，接种密度为106，接种于不同细胞培养板中培养在培养箱。24 h后细胞贴壁，48 h后心肌细胞同步性的搏动，倒置相差显微镜观察心肌细胞活动状态(见图1 )，心肌细胞搏动的频率各不相同(23～207次/min)，以60～90次/min居多。2d后更换为10%胎牛血清的培养液。48 h后换无血清培养液，之后根据细胞代谢状况每2d换无血清培养液1次。

图1 培养2d的单个心肌细胞

1.2 心肌细胞分离、纯化 将原代心肌细胞培养液装入离心管中，1000 r/min离心5 min，用培养液重悬细胞，细胞计数后选择1×105制成细胞悬液，将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入96孔细胞板中，每孔100 μL，使其均匀分布，将培养皿转入CO2培养箱中培养，第2天加药处理。

1.3 Alamar Blue法测定细胞活力 在V型96孔中加入196 μL无FBS/PS的培养基。建立氧化损伤模型，分为对照组、H2O2损伤组、丹参多酚酸盐组和抑制剂组，在V型96孔板中分别加入 H2O2(100 μmol/L)，H2O2(100 μmol/L)+ 丹参多酚酸盐(上海绿谷制药有限公司，0.05 g/L、0.1 g/L、0.5 g/L)，抑制剂10 μmol/L。在96孔细胞板中加入药物10 μL/孔，处理72h后检测。

1.4 Western blot法检测TGF－β和Smad2/3蛋白表达情况①蛋白质抽提:将细胞培养在60 mm培养皿中，收集培养液中的死细胞和贴壁的活细胞于制备好的裂解液浸提。将浸提好的样本，于4℃、10000 r/min条件下离心5 min。将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。②采用Bradford方法进行蛋白质浓度的测定:标准曲线制作后，向加入考马斯亮蓝溶液的各离心管中加入99 μL 0.15 mol/L NaCl溶液和蛋白质抽提液，混匀放置5 min，将溶液倒入比色杯中，在做好标准曲线的程序下按sample测样品，每测定完一个样品，用无水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5 mL)，再用无菌水洗1次，然后测定下一个样品，测定完毕，得到样品的蛋白质浓度数据。③实验:首先制作分离胶和浓缩胶，将配置好的胶组装入垂直板电泳槽中，将样品按比例混合上样缓冲液，蛋白质分子量指示剂为预染标记。接着电泳操作，直至溴酚蓝电泳到达胶底部，关闭电源，电泳操作完成。在转印槽中转膜，放入组装好的夹心设备，接通电源，根据目的蛋白分子量大小转印，30～45 min后，转印完成。取下转印好的PVDF膜，放于5%的脱脂牛奶中，轻轻摇动，封闭1 h。一抗孵育和二抗孵育后，显影、定影，对晾干后的胶片进行图像扫描、分析。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计处理。结果以均数±标准差(±s)表示，采用Duncan法进行单因素方差分析，用LSD－t检验进行两个参数比较，采用相关分析进行两个变量间的关系分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌细胞活性比较 对照组、H2O2损伤组、丹参多酚酸盐0.05 g/L组、丹参多酚酸盐0.10 g/L组、丹参多酚酸盐0.50 g/L组和抑制剂组细胞活性分别为(100.00±8.50)%，(99.44 ±1.69)%，(116.16 ± 4.22)%，(146.67 ±5.05)%，(74.49 ±0.09)%，(81.70 ± 8.83)%。H2O2损伤组细胞活力与对照组比较差异不显著;丹参多酚酸盐0.05 g/L组和0.1 g/L组细胞活力明显高于对照组(P均＜0.01)，而丹参多酚酸盐0.5 g/L组和抑制剂组细胞活力明显低于对照组(P均 ＜0.01)。

2.2 TGF－β受体和Smad2/3蛋白表达 与TGF－βR1相比，Smad2/3蛋白含量对H2O2处理后丹参多酚的处理浓度相对滞后，由此可推测，在信号通路中Smad2/3蛋白位于TGF－βR1的下游。见图2。

2.3 Western blot检测TGF－β受体和Smad2/3蛋白表达量H2O2损伤组TGF－βR1和Smad2/3含量高于对照组;丹参多酚酸盐0.05 g/L组和0.1g/L组TGF－βR1和 Smad2/3含量均明显低于H2O2损伤组(P均＜0.05)。丹参多酚酸盐0.5 g/L组TGF－βR1和Smad2/3含量明显高于H2O2损伤组。抑制剂组TGF－βR1和Smad2/3含量明显低于H2O2损伤组(P均 ＜0.05)。见表1。

图2 TGF－β1受体和Smad2/3蛋白表达情况

表1 各组TGF－β受体和Smad2/3蛋白表达量(±s)

表1 各组TGF－β受体和Smad2/3蛋白表达量(±s)

组别 TGF－β受体Smad2/3对照组0.26 ±0.030.37 ±0.14 H2O2 损伤组 0.64 ±0.230.70 ±0.36丹参多酚酸盐0.05 g/L 组 0.37 ±0.090.41 ±0.28丹参多酚酸盐0.1 g/L 组 0.50 ±0.180.35 ±0.16丹参多酚酸盐0.5 g/L 组 0.82±0.241.42±0.52抑制剂组0.06 ±0.010.21 ±0.01

3 讨论

心脏疾病一直是医学界研究的热点和难点。心肌细胞是心脏的基本构成单位。离体培养的原代心肌细胞作为一种重要的研究模型，可保存心肌细胞体内大部分形态结构，同时保持功能上的某些特点，可进行各种心肌细胞生理、病理、代谢、药理、生长发育等基础研究[2]，为探索心肌细胞在非血流动力学因素下作用机制提供了良好的实验工具，已被广泛应用于心血管疾病的研究。

心肌细胞增殖分化和心肌细胞肥大是心肌细胞生长的2种形式，引起心肌收缩能力减弱，从而使心脏的血液排出量减少，逐渐恶化的心功能导致心力衰竭。心力衰竭是各种病因导致心脏损害的最终归宿，可严重影响患者的生活质量，对人类健康产生严重危害。在心力衰竭发生发展过程中，心脏重构是一个重要病理生理过程，包括细胞胶原纤维网的重构、心肌细胞的重构、细胞外基质的重构。TGF－β是一种多肽类生长因子，广泛存在于多种组织和细胞中，具有多种功能，能促进细胞增殖、分化和细胞外基质分泌，从而参与调控生物体免疫调节、胚胎发育、血管形成等生理过程[3]。TGF－β是心肌重构过程中一条重要的信号通路，在心肌重构过程中发挥至关重要的作用。

TGF－β 有 TGF－β1～5亚单位[4]，哺乳动物有 β1、β2、β33种亚单位，其中TGF－β1在体细胞中所占比例最高、活性最强、分布广泛。TGF－β1最初是以无活性的前体蛋白形式出现，经酶解后形成有活性的TGF－β1[5]。在心肌肥大过程中TGF－β1发挥作用。压力刺激及AngⅡ等各种因素刺激下，心肌局部以自分泌和旁分泌方式分泌 TGF－β1，后者在心肌肥大、心力衰竭中发挥着重要作用[6]。

丹参是一种传统的活血化瘀中药，在临床上广泛用于治疗心血管疾病。我国目前生产的丹参及其复方制剂品种繁多，有效成分不明确是丹参及其复方制剂等产品存在的普遍现象，结果是引起临床疗效不够稳定。通过对丹参有效成分进行研究发现，丹参活血化瘀作用的最有效活性成是丹酚酸B，丹酚酸B具有抗血小板、抗氧化、拮抗钙离子内流、抗再灌注损伤、抗神经退行性变等作用[7]。注射用丹参多酚酸盐是由中药丹参经提取精制的多酚酸盐类化合物制备而成，丹酚酸B镁含量超过80%。丹酚酸B在心血管系统方面具有广泛的药理作用，对脂质过氧化引起的细胞膜损伤有明显的保护作用[8]。近年来研究显示丹酚酸盐有保护内皮细胞、改善内皮功能，抗动脉粥样硬化、抑制血小板聚集和抗血栓形成作用，对心肌具有保护作用[9]。

首先，丹酚酸B有保护心肌作用。武骏等[10]研究显示，丹酚酸B可能通过降低心率及增加冠脉血流量，从而改善病变心肌供氧和耗氧平衡，发挥保护心肌的作用。其次，丹酚酸B对冠状动脉粥样硬化有预防作用。1989年初发现血管内皮生长因子/血管通透因子(VEGF)是一种高度特异的、多功能的血管内皮促分裂因子和血管生成因子。它的作用没有种属特异性，在已知的生长因子中，只有VEGF可诱导蛋白外渗和血管通透性增加。张黎等[11]报道，丹酚酸B通过抑制内皮细胞中血管内皮生长因子蛋白及血管内皮生长因子的表达，发挥预防和治疗冠状动脉粥样硬化的作用。另外，丹酚酸B有抑制血小板聚集和抗血栓作用。韩纪举等[12]研究结果显示，丹酚酸B通过抑制血小板释放各种递质和/或阻止血小板上胶原受体与相关表面的胶原蛋白结合，表明丹酚酸B具有明显的抗血小板黏附聚集作用。

本研究结果发现，细胞活力与丹参多酚酸盐处理之间有一定的浓度效应，浓度为0.05 g/L和0.1 g/L丹参多酚酸盐处理使细胞活力明显上升。Western实验结果显示，H2O2处理使细胞TGF－βR1含量上升，0.05 g/L和0.1 g/L丹参多酚酸盐处理可明显抑制由于H2O2处理引起的TGF－βR1和SMAD2/3含量上升，而抑制剂可明显地抑制TGF－βR1和SMAD2/3表达，使含量极明显地下降。研究还发现，不同浓度的丹参多酚酸盐组Smads蛋白表达水平不一致，说明在不同浓度下可能有不同的抗氧化机制，以浓度为0.1 g/L抗氧化损伤作用最强。另外，信号通路中Smad2/3蛋白位于TGF－βR1的下游，这一点符合了就可以解释TGF－b/smad信号通路激活。

总之，TGF－β是心肌重构过程中的一条重要信号通路，氧化应激对该通路具有活化作用，丹参多酚酸盐对氧化损伤后心肌细胞中TGF－β信号通路具有抑制作用，从而减轻心肌重构。本研究为丹参多酚酸盐抗氧化损伤防治心肌细胞重构的作用提供了理论依据，为心力衰竭的预防提供了新思路。

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