丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法的应用研究

时慧挺

丙型肝炎病毒(HCV)为通过血液或者是血液制品进行传播的一种病毒, 在输血过程中丙型肝炎病毒传染为一个无法忽视的途径, 已经受到了广大医学工作者和患者的重视。流行病学调查结果显示HCV感染的发生率较高, 分布较广, 出于对输血引起HCV传播进行控制的目的, 临床需对献血者展开抗-HCV检测［1］。本次研究中出于对丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法的临床应用效果进行分析探讨的目的, 对230份阴性血液标本和230份质控血液标本展开了相关检测, 并对其检测结果进行了统计分析, 现汇报如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 标本来源于2012年1月～2013年12月间本院血液筛查阴性标本, 抽取其中的230份作为研究对象,另收集230份质控标本。

1.2 方法

1.2.1 研究方法 对以上统计460份血液标本展开相关检测, 采取双抗原夹心法对丙型病毒肝炎抗体进行检测, 并对检测结果进行统计分析。

1.2.2 检测方法 所需试剂包括：吉比爱、Ortho 丙肝病毒抗体酶联免疫诊断试剂, 除此外还需要ChironRIBA 确认试剂。

抗原制备：嵌合表位抗原经包涵体的形式表达, 利用离子交换层析方式展开纯化, 而后经 Sephadex G-50 柱凝胶过滤收集, 经SDS-PAGE对抗原蛋白展开鉴定。

双抗原夹心法：采取浓度为50 mmol/L的碳酸盐缓冲液对抗原进行稀释, 多肽抗原工作浓度为：结构区多肽15 lg/ml, NS4区多肽0.5 lg/ml, NS5区多肽0.25 lg/ml, 基因工程表达抗原工作浓度C7为1 g/ml, C11为1 g/ml。在每个孔中加入100 μl, 37℃条件下放置1 h, 而后在4℃冰箱中过夜保存,经浓度为30%的小牛血清PBST进行封闭, 每孔加入200 μl,在37℃条件下放置1 h, 将封闭液弃去, 取50 μl样品稀释液,每孔加5 μl, 37℃条件下放置30 min, 而后经PBST冲洗5次。取最适合的酶稀释度, 经棋盘滴定法每孔加入50 μl工作浓度的酶标记抗原, 37℃条件下放置15 min, 经PBST冲洗5次,每孔加入50 μl底物缓冲液和50 μl显色剂, 37℃条件下放置10 min, 充分显色。而后每孔加入50 μl浓度为2 mol/L的硫酸,终止反应, 采取酶标仪在450 nm波长下对吸光度进行检测,检测结果≥临界值者视为阳性, 反之为阴性。

2 结果

采取双抗原夹心法对上述标本进行检测后, 共检出136份HCV抗体阳性标本, 有2份标本没有检出, 经ChironRIBA确认试剂检测证实这2份标本均为阳性, 双抗原夹心法检测敏感性为98.55%。详见表1。

表1 双抗原夹心法与ChironRIBA 确认试剂检测结果比较

3 讨论

流行病学调查结果显示［2］, HCV感染表现出显著的世界性分布, 在我国HCV感染者约有4000万, 血液传播为其主要传播途径, 其中输血为血液传播的一种主要形式, 因此在对HCV感染血液传播进行有效控制的过程中, 临床需对献血者展开抗-HCV检测。现阶段采取酶联免疫吸附试验对抗-HCV抗体进行检测为临床诊断HCV感染的主要手段。在实施抗-HCV酶联免疫诊断时所需试剂均为二抗作酶结合物,由于血清中IgG的含量相对较高, 因此少量的特异吸附会引起假阳性结果的出现, 进而对诊断结果和准确性产生影响。

PCR法对HCVRNA进行检测时, 可依据检测结果对HCV感染进行早期诊断, 然而临床实践证实, 该方法相对费时、费力, 且试剂费用也较为昂贵, 临床普及存在困难, 特别是在基层医院, 因此对新型有效检测方法进行开发具有很大的必要性, 对于HCV感染的诊断具有重要意义。

霍乱毒素B亚基融合蛋白表达系统通过可溶性可表达获得CTB2HCV融合蛋白抗原, 适用于酶标记抗原的制备, 然而由于CTB与大肠杆菌热不稳定性肠毒素B亚基(LTB)存在较强的免疫交叉反应, 人血清中LTB抗体含量较高, 可能对基于融合蛋白的双抗原夹心ELISA系统产生较为严重的非特异性反应, 在大肠杆菌中表达了大肠杆菌噬体MS2DNA多聚酶与HCV抗原决定簇的融合蛋白, 将HRP标记的CTB2HCV融合蛋白决定簇的融合蛋白, 对双抗原夹心的ELISA系统进行建立。

近几年双抗原夹心法在丙型肝炎病毒抗体检测中逐渐被应用, 且取得了良好的效果, 曾有学者对269份HCV抗体阳性标本采取双抗原夹心法进行检测, 结果仅3份未检出, 检测敏感性为98.84%［3］。本次研究中对138份HCV抗体阳性标本进行检测, 结果发现, 双抗原夹心法检出136份, 仅2份标本未检出, 敏感性为98.55%, 与相关文献报道结果接近。

因双抗原夹心法不需要对血清产品进行稀释, 不会受到类风湿因子等因素的干扰, 具有较高的特异性, 并且同时可以对血清中各类抗体进行检测, 特别是IgM类抗体, 有效缩短了从病毒感染到经ELISA法检出抗体之间的“窗口期”。因此采取双抗原夹心ELISA法可以使HCV感染诊断试剂的特异性、检出率得以显著提高, 缩短了检测时间, 临床意义重大, 值得临床关注并推广。

［1］ 刘文玉.酶联法检测丙型肝炎病毒抗体阳性分析.白求恩军医学院学报, 2010,12(03):175.

［2］ 乔伟振.丙型肝炎病毒不同基因型NS3蛋白的抗原异质性分析.中华微生物学和免疫学杂志, 2009,10(01):151.

［3］ 张桂芳.溶血对双抗原夹心法检测HIV抗体的影响.实用医学杂志, 2010,17(13):155.