头孢丙烯片在健康受试者体内的生物等效性研究

王咏梅　佟杰 曾永箎

【摘 要】目的：建立人血浆中头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体的高效液相测定法，并评价两种制剂的人体生物等效性。方法：单剂口服头孢丙烯片0.5g后，血样经处理后，进行HPLC分析。结果：头孢丙烯顺式（Z）异构体的线性范围为0.1000～16.0000 ?g?mL-1，提取回收率为94.9%～96.0%；头孢丙烯反式（E）异构体的线性范围为0.0200～1.6000 ?g?mL-1，提取回收率为92.7%～94.1%。人体中受试制剂和参比制剂的头孢丙烯顺式（Z）异构体的药代动力学参数为：Cmax为（7.93±1.87）和（7.82±1.76）?g?mL-1，Tmax为（1.75±0.67）和（1.81±0.61）h，t1/2为（1.35±0.15）和（1.32±0.16）h ，AUC0-t为（24.56±3.44）和（24.71±3.85） ?g?h?mL-1，；头孢丙烯反式（E）异构体的药代动力学参数为：Cmax为（0.70±0.15）和（0.68±0.16）?g?mL-1，Tmax为（1.72±0.52）和（1.77±0.62）h，t1/2为（1.20±0.28）和（1.24±0.21）h ，AUC0-t为（2.02±0.33）和（2.00±0.44） ?g?h?mL-1。结论：本方法灵敏、准确、简便，适用于临床药代动力学研究；两制剂生物等效。

【关键词】头孢丙烯顺式（Z）异构体；头孢丙烯反式（E）异构体；高效液相色谱法；生物等效性

【中图分类号】R978.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）05-2754-02

头孢丙烯为第二代头孢菌素类抗生素，具有广谱抗菌作用[1]。本品的作用机制是抑制细菌细胞壁的合成，使细菌迅速破裂溶解。临床用于治疗敏感菌所致的轻、中度感染，包括上呼吸道感染，下呼吸道感染及皮肤和皮肤软组织感染。头孢丙烯中顺式异构体的含量在90 %以上，而反式异构体只占10 %以下。顺反式异构体在化学稳定性和抗GP（革兰阳性）链球菌和葡萄球菌活性方面是相同的，但在抗GN（革兰阴性）大肠埃希杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血杆菌方面，顺式头孢丙烯的抗菌活性是反式头孢丙稀的6～8倍。目前国内尚无同时测定头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体含量并进行生物等效性的报道。本文建立了高效液相色谱同时测定人血浆中头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体浓度的方法，用于头孢丙烯在人体的药代动力学研究。

1材料与方法

1.1 药品与仪器

受试制剂（A药）：规格：0.25 g/片，批号：091006，北京赛科药业有限责任公司提供；参比制剂（R药）：商品名：施复捷?，规格：0.25 g/片，批号：0905773，中美上海施贵宝制药有限公司生产。

头孢丙烯顺式（Z）异构体对照品（含量：92.7 %，批号：H01099）；头孢丙烯反式（E）异构体对照品（含量：89.5 %，批号：H05336），均由厂家提供；头孢拉定对照品（含量：91.8 %，批号：130427-200306），购自中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈均为色谱纯，三氯乙酸和二氯甲烷均为分析纯；水为纯净水；空白血浆由吉林大学第一医院提供。

LC-10ATvp高效液相色谱仪，配有LC solution Lite工作站（日本岛津公司）；XW-80A旋涡混合器（上海沪西仪器厂有限公司）；TGL-16C高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；AUW120D分析天平（日本岛津公司）；雷磁pHS-3E pH计（上海精密科学仪器有限公司）；KS康式振荡器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）。

1.2 受试对象

18名健康男性志愿者，年龄20～24岁，体重为54～70 kg，体重指数（BMI）为20～24（BMI=体重（Kg）/身高（m）的平方）。于试验前在医院接受全面的体格及化验检查，结果血、尿常规，肝、肾功能正常，心电图正常，均符合受试者入选要求。试验前2周内未服用任何药物。受试者试验前均签署知情同意书。试验方案经吉林大学第一医院医学伦理委员会批准。临床试验于吉林大学第一医院进行。

1.3 给药方案与血样采集

试验采用双周期自身对照交叉试验设计。18例受试者随机分成2组，每组9人。受试者试验日晨采集空白血样后，空腹口服受试制剂2片或參比制剂2片以250 mL温开水送服并做记录。服药后2 h可饮水，4 h进统一清淡饮食。分别在给药后的0.25、0.5、0.75、1.0、1.25，1.5、2、2.5、3、4、5、6、8小时由静脉采血5 ml，置肝素化试管中，离心10min（3500 r·min-1），分离血浆，于-70℃冰箱中保存待测。

1.4 血药浓度测定

1.4.1 色谱条件

色谱柱：依利特ODS（250×4.6 mm，5 μm）；预柱：C18 保护柱；流动相：0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调pH值2.60 ± 0.05）-乙腈（85：15）；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 ml/min；进样量：50 μl。

1.4.2 血浆样品处理

精密量取血浆样品500 μl，加入甲醇-水（1：1）100 μl，加入内标溶液（100.2000 μg/ml头孢拉定）50 μl，20 %三氯醋酸100 μl，漩涡混合1分钟，14000 rpm离心6分钟，取上层液转置于10 ml离心管中，依次加入乙腈0.5 ml和二氯甲烷2 ml，振荡6分钟，12000 rpm离心6分钟，取上层液转置于1.5 ml离心管中，14000 rpm离心6分钟，取50 μl上清液进样分析。

1.4.3 标准曲线的制备

精密量取空白血浆500 μl，分别加入头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体标准系列溶液各50 μl，配制成血浆中头孢丙烯顺式（Z）异构体浓度为0.1000，0.3000，1.0000，2.0000，4.0000，8.0000，16.0000 μg/ml和头孢丙烯反式（E）异构体浓度为20.0，40.0，100.0，200.0，400.0，1000.0，1600.0 ng/ml的血浆样品，按“血浆样品处理方法”项下自“加入内标溶液（100.0000 μg/ml头孢拉定）50 μl”起同法试验，每一浓度进行双样本分析，制备头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体的标准曲线。以待测物浓度为横坐标X，待测物与内标物的峰面積比值（AS/Ai）为纵坐标Y，用加权最小二乘法[2]（权重系数：1/X2）进行线性回归运算，求得的线性回归方程即为标准曲线方程。结果表明，头孢丙烯顺式（Z）异构体在0.1000 ～ 16.0000 μg/ml范围内、头孢丙烯反式（E）异构体在20.0 ～ 1600.0 ng/ml范围内分别与待测物和内标物峰面积之比线性关系良好，浓度测定结果均达到试验要求的精密度与准确度[3]。

1.4.4 精密度与准确度

精密量取空白血浆500 μl，分别加入不同浓度的头孢丙烯顺式（Z）异构体和反式（E）异构体质控标准溶液50 μl，配制成血浆中头孢丙烯顺式（Z）异构体浓度为0.2000，1.6000和12.8000 μg/ml、头孢丙烯反式（E）异构体浓度为50.0，300.0和1280.0 ng/ml的血浆样品（每浓度六样本分析），按“血浆样品处理方法”项下自“加入内标溶液（100.0000 μg/ml头孢拉定）50 μl”起同法试验，连续测定三批（与标准曲线的测定同时进行），计算血浆样品的浓度，求得方法的精密度与准确度。结果表明，头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体的低、中、高3个浓度QC样品的批内、批间RSD均小于15%，符合有关的国际规范要求[3]。

1.4.5 提取回收率

精密量取空白血浆500 μl，分别加入不同浓度的头孢丙烯顺式（Z）异构体和反式（E）异构体质控标准溶液50 μl，配制成血浆中头孢丙烯顺式（Z）异构体浓度为0.2000，1.6000和12.8000 μg/ml，头孢丙烯反式（E）异构体浓度为50.0，300.0和1280.0 ng/ml的血浆样品（每浓度六样本分析），按“血浆样品处理方法”项下自“加入内标溶液（100.2000 μg/ml头孢拉定）50 μl”起同法试验，获得相应色谱峰面积；另取对应浓度的头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体质控标准溶液各50 μl，加入内标溶液（100.0000 μg/ml头孢拉定溶液）50 μl，甲醇-水（1：1）600 μl（每浓度六样本分析），涡旋混合30秒，取50 μl上清液进样分析，获得相应色谱峰面积（六次测定的平均值）。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。结果表明，3种浓度下头孢丙烯顺式（Z）异构体的提取回收率分别为95.1%，94.9%和96.0%；头孢丙烯反式（E）异构体分别为92.9%，94.1%和92.7%，内标提取回收率为91.0，符合有关规定[3]。

1.4.6 血浆样品的稳定性

制备低、中、高3个浓度的血浆样品各3份，共配制3组，分别进行室温、反复冻融及-70℃冻存条件下稳定性试验。结果测定RSD均在15%以内，表明头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体血浆样品在室温放置24 h、反复冻融3次及-70℃冻存条件下31天均稳定性良好。

1.5 数据分析

采用Phoenix WinNonlin 6.0数据统计软件处理血药浓度数据并进行计算。Tmax和Cmax均为实测值，药-时曲线下面积（AUC0-t）按梯形面积法计算。对Cmax、AUC的对数转换值及Tmax的实测值进行方差分析、双单侧t检验和90%置信区间估计，评价两制剂的生物等效性。

2 结果

2.1 专属性

色谱图结果表明，头孢丙烯顺式（Z）异构体保留时间为8.8分钟左右，头孢丙烯反式（E）异构体的保留时间为13.8分钟左右，头孢拉定的保留时间为15.4分钟左右，血浆中内源性物质不干扰头孢丙烯顺式（Z）异构体、反式（E）异构体和内标物头孢拉定的测定（A为头孢丙烯顺式（Z）异构体，B为头孢丙烯反式（E）异构体，C为头孢拉定）。因此本方法具有良好的专属性，符合测定要求。结果见图1。

异构体标准溶液和内标的样品色谱图

（峰A为头孢丙烯顺式（Z）异构体；峰B 为罗头孢丙烯反式（E）异构体；峰C为头孢拉定（内标））

（峰A为头孢丙烯顺式（Z）异构体；峰B 为罗头孢丙烯反式（E）异构体；峰C为头孢拉定（内标））

2.2 血药浓度-时间曲线

18名健康受试者单剂量口服头孢丙烯顺式（Z）异构体受试制剂和参比制剂后，平均血药浓度-时间曲线见图2。

2.3 血药浓度及药代动力学参数

18名受试者单剂量口服受试制剂和参比制剂后头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体的主要药代动力学参数见表1。

2.4 生物等效性评价

以AUC0-t计算，头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体的相对生物利用度分别为102.2 % ± 13.7 %和103.5 % ± 15.2。对头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体的主要药动学参数经对数转换后进行方差分析，并进一步采用双单侧 t 检验进行生物等效性评价。头孢丙烯顺式（Z）异构体AUC0-t和AUC0-∞的90%置信区间为100.3%～110.7%和100.4%～110.6%；Cmax的90%置信区间为98.3%～112.8%和94.6%～103.9% ，Tmax在受试制剂与参比制剂间无显著性差异。头孢丙烯反式（E）异构体的AUC0-t和AUC0-∞的90%置信区间为94.5%～103.6%和94.5%～103.7%，Cmax的90%置信区间为98.3%～112.8%和94.6%～103.9%，Tmax在受试制剂与参比制剂间无显著性差异。

3 討论

血浆样品处理时，如果不用乙腈和二氯甲烷除杂，色谱图上待测物及内标处会有杂质峰的干扰。本法提取回收率较高，且方法的重现性较好。与有关文献比较[4]，该法灵敏度高且选择性好，完全可以满足临床药代动力学的要求。

采用HPLC法研究头孢丙烯片在健康志愿者体内的药代动力学过程。结果表明，18名健康男性志愿者分别口服0.5g头孢丙烯片受试制剂与参比制剂后，两制剂的主要药代动力学参数（Cmax，AUC）经对数转换后，方差分析结果表明头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体在两种制剂间、周期间无显著性差异（P>0.05），个体间有显著性差异（P<0.05），说明两药物在人体内的吸收分布过程基本相似；经双单侧t检验和[1-2α] 置信区间分析，头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体受试制剂的AUC0-t和AUC0-∞的90%置信区间在参比制剂相应参数的80%～125%内，表明头孢丙烯顺式（Z）异构体和头孢丙烯反式（E）异构体受试制剂与参比制剂具有生物等效性。

在临床试验过程中，医生对受试者进行严格监护，未观察到临床不良反应现象；受试者在试验后进行体检，检测指标有超出正常值范围者，经临床医生判断无临床意义。

参考文献

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典临床用药须知（化学药和生物制品卷）[M]. 人民卫生出版社，2005：485-486.

[2] 钟大放. 以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题[J]. 药物分析杂志，1996，1（5）：343-346.

[3] 国家药典委员会. 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则（中华人民共和国药典二部2010年版）[M]. 化学工业出版社，2010，附录：195-199.

[4] Tae-Hwan Park， Jin-Ki Kim， Jun-Pil Jee， et al. HPLC method for simultaneous determination of cefprozil diastereomers in human plasma [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2004，36：243-248.