橡胶草种植前后土壤微生物细菌多样性研究（Ⅱ）

梁素钰　李琳　杜倩等

摘要 [目的]研究橡膠草种植前后土壤微生物细菌的多样性。[方法]对大田种植橡胶草前后的土壤理化性质进行考察，并通过454测序技术对土壤微生物细菌多样的数据序列进行高级分析。[结果]橡胶草种植后土壤的全氮和全磷略高于种植前，有机质稍有下降。土壤细菌的OTU数在橡胶草种植前后相差不大。群落结构分析表明，橡胶草种植前后的细菌组成大致相同，但各物种所占比例有差异，大多数的细菌是不可培养的，其中与氮有关的菌属柱状区所占比例最大。PCA主成分分析表明橡胶草种植前后土壤微生物群落在细菌水平上相近，这个结果与群落分布柱状图相吻合。RDA分析表明，土壤pH值、有机质、土壤含水率、土壤全氮和全磷与细菌呈正相关，土壤容重与细菌呈负相关。[结论]试验测序数据表明，橡胶草种植前后的土壤微生物细菌在OUT水平上多样性丰富，在属的水平上群落结构组成相近，种植橡胶草后土壤理化性质发生了改变。

关键词 橡胶草（Taraxacum koksaghyz Rodin）；454测序；细菌；多样性；土壤微生物

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）08-02264-03

Research of Soil Microbial Bacteria Diversity before and after Planting Taraxacum koksaghyz （Ⅱ）—Advanced Analysis

LIANG Suyu et al

（Key Lab of Sustainable Management of Forest and Environmental Microbiology， Heilongjiang Institute of Forest Engineering and Environment， Harbin， Heilongjiang 150081）

Abstract [Objective] To study soil microbial diversity before and after planting Taraxacum koksaghyz. [Method] Soil physical and chemical characters before and after planting Taraxacum koksaghyz were investigated， 454 sequence technology was used to conduct advanced analysis of soil microbial diversity data sequence. [Result] The results showed that the soil total nitrogen and phosphorus in Taraxacum koksaghyz field were slightly higher than comparison field， while the organic matter was decline slightly. The OTU numbers of bacteria was almost same in both Taraxacum koksaghyz field and comparison field. Community composition analysis shows that in the case of Genuss level of community distribution histogram， the bacteria in both fields were similar， just a slightly difference in the proportion of each species. The majority of bacteria are nonculturable， in which the nitrogenrelated species with the largest proportion of columnar zone occupied most. PCA principal component analysis showed that the community composition of bacteria in both fields were similar， this result is consistent with the community distribution histogram. RDA analysis showed that soil pH， organic matter， soil moisture， soil total nitrogen and total phosphorus are associated with bacteria positively， soil bulk density was negatively correlated with bacteria. [Conclusion] The test sequence data indicated that there is an OUT abundance diversity in bacteria and the similar bacterial community structure in Genus level.The soil propeties changed after planting Taraxacum koksaghyz Rodin.

Key words Taraxacum koksaghyz； 454 sequence； Bacteria； Diversity； Soil microbe

橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）为菊科（Compositae）蒲公英属（Taraxacum）多年生宿根草本植物，喜冷凉气候，根部所含的胶质能制橡胶。新疆、甘肃、陕西以及东北﹑华北﹑西北等地有栽培。研究者对橡胶草体内橡胶的形成及品质变化、体内碳水化合物、果聚糖、多酚氧化酶等化学成分进行了研究[1-10]。为解决国内天然橡胶供应不足问题，中央轻工业部曾组织调查团前往新疆对发现的大面积野生橡胶草进行全面考查[11-12]。

近年来，随着橡胶草的利用越来越大[13-17]，人们对橡胶草的研究维度更加多样化，从田间种植、组织培养，到分子水平的蛋白质、转基因等进行了一系列的研究[18-30]。试验主要利用454技术[31-32]对北方田间种植橡胶草前后的土壤注微生物细菌多样性进行研究，并对所测序列进行数据高级分析，以期为橡胶草的种质栽培提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以5 m×5 m为试验单元，于种植1年橡胶草和未种植橡胶草的地块，尽量靠近橡胶草根蛇形分别取5个土样，每个样品50.0 g，混勻，过40目土壤筛；过筛后的土样用锡纸包裹，置于液氮中带回实验室。用KOK表示种植橡胶草后的样本，用CK表示种植橡胶草前的样本。

1.2 方法

1.2.1

样品的指标成分分析。土壤物理性质包括土壤含水率和容重，采用烘干法，每份样品各项指标重复测定3次。土壤化学性质的测定包括土壤全氮、全磷、pH值和有机质；其中，全氮含量采用半微量凯氏法（GB7113-87），利用全自动凯氏定氮仪进行测定；全磷含量采用钼锑抗比色法，利用紫外分光度计测定，每份样品各项指标重复测定3次；土壤pH值利用pH仪测定；有机质采用常规实验室方法测定。

1.2.2

样品OTU分布VENN分析。统计多个样品中所共有的OTU（Operational Taxonomic Units，可操作的分类单元）数目反映环境样品的相似性及重叠情况，统计结果以venn图表示。分析时选用相似水平为97%的OTU，此时OTU的数目也可以代表菌种的数目。使用mothur软件进行分析。

1.2.3

群落结构分析。使用mothur软件，根据silva库中的参考序列对OTU进行种属鉴定并进行分类。结果中包含了该样品中含有何种微生物和这些微生物各自所含有的序列数即微生物的丰度信息。

1.2.4

PCA（主成分）分析。采用PCA主成分来分析不同样品OTU组成的差异，通过方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴取能够最大反映方差值的2个特征值，可以用来进行以下分析：确定环境中的样品是否具有不同的微生物群落；将环境间的差异以图的形式表现出来等。

1.2.5

RDA分析。RDA是基于对应分析发展而来的一种排序方法，将对应分析与多元回归分析相结合，每一步计算均与环境因子进行回归，又称多元直接梯度分析。此分析可以检测环境因子、样品、菌群三者之间的关系或者两两之间的关系。

2 结果与分析

2.1 样地信息与理化性质

由表1可知，橡胶草种植后土壤的全氮和全磷略高于种植前，有机质稍有下降。

2.2 样品OTU分布比较——VENN分析结果

图1表明，种植橡胶草的土壤细菌有4 919个OTU，未种植橡胶草对

2.3 群落结构分析

使用统计学的分析方法，将多个样品的群落结构分析放在一起对比，以观测其变化情况。试验选取了50个具有代表性的细菌菌属进行绘图，结果表明，不同的颜色代表不同的种群，橡胶草种植前后的土壤细菌组成在属的水平大致相同，各物种所占比例有所差异。图中的信息显示大多数的细菌是不可培养的，其中淡粉色的柱状区所占比例最大是与氮有关的菌属。

2.4 PCA（主成分）分析

PCA分析可以用来反映不同样品中微生物群落组成的相似性以及影响微生物多样性的主要因素。样品组成越相似，反映在PCA图中的距离越近。图3表明，橡胶草种植前后土壤微生物群落在细菌水平上处于相同象限，所以生物群落组成相近。

2.5 RDA分析

RDA图是根据属水平的物种制作出来的，但这些属的物种其实也是OTU，只是将特定的能在属上分出类别的OTU筛选出来。箭头是根据环境因子与样品之间的关系加进去的。图4表明，土壤pH值、有机质、土壤含水率、土壤全氮和全磷与细菌呈正相关，土壤容重与细菌呈负相关。样本在图中的分散度也说明了土壤微生物在属的水平上有很大差异。

3 结论与讨论

试验主要针对样地的理化性质以及获得样品序列数据的OTU进行土壤微生物群落结构、PCA主成分和RDA的高级分析。序列的OTU选取是在0.03水平，即97%相似性水平下，和基础分析选取的序列OTU一致。因为先用speciessample数据进行DCA分析，分析结果中Lengths of gradient 的第1轴的数值小于3.0，所以试验选取RDA来进行分析。土壤的全氮和全磷水平在橡胶草种植后略有上升，但有机质呈下降趋势。这可能是因为在种植橡胶草时，选取的土质不是很好的杂草丛生的荒地，当土地由多物种并存转化成单一物种生长时，是否会存在有机质下降，这也是一个值得继续深入探讨的话题。另外，样品的选取是在种植橡胶草1年后，若种植年数增加，土壤的理化性质和土壤微生物的相互影响或许表现得更明显。

试验测序数据高级分析得出如下结论：①橡胶草种植前后土壤微生物细菌在OUC水平上多样性丰富；②橡胶草种植前后的土壤微生物细菌，在属的水平上群落结构组成相近，变化不大；③种植橡胶草前后土壤理化性质发生了改变。

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