急性脑梗死患者血清炎症因子mRNA 表达与颈动脉斑块性质关系的临床研究

孙志华，李 兰，康志新，贺 婕

颈动脉斑块形态、粥样硬化的严重程度以及是否容易脱落成栓子等，在脑梗死的发病中起重要作用。炎症机制在动脉粥样硬化及心脑血管病病理损害的作用和地位日益受到人们的认可，众多炎症因子在此过程中起着重要的作用。本研究观察急性脑梗死患者血清炎症因子基因表达水平与颈动脉斑块的关系，为探索脑梗死有效的临床干预措施提供了新的思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象 病例组：急性脑梗死患者128例，符合下列条件：发病48h内入院；符合第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准，均经头CT 和／或磁共振成像（MRI）证实；初发脑梗死，既往无神经系统疾病史。病例排除标准：既往患有免疫系统疾病、肿瘤；发病前后存在感染者；发病前后使用激素、免疫抑制剂、非甾体类抗炎药物；合并其他脏器严重并发症（心、肝、肾功能不全）；确诊系因动脉炎发病的脑梗死患者。对照组：收集同时期门诊常规体检的患有高血压、糖尿病、高脂血症、高黏血症等基础疾病者65例，其中男40例，女25例，年龄44岁～79岁（61.59岁±11.60岁），年龄、性别、伴随疾病等情况与脑梗死组比较差异无统计学意义。

1.2 方法 对两组患者外周血进行白介素－6（interleukin－6，IL－6）、白介 素－10（interleukin－10，IL－10）、肿 瘤 坏 死 因 子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）mRNA 表达的测定以及颈动脉超声检查颈动脉斑块情况。

1.2.1 标本采集和总RNA 提取 所有研究对象于入组当天抽取静脉血5mL，病例组采血必须在治疗前。血液标本采集后3h内进行总核糖核酸（RNA）的提取。加入适量的Trizol裂解细胞，再依次加入适量的氯仿、异丙醇、75%乙醇和DEPC水，分别纯化、沉淀、洗涤和溶解总RNA。微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度，吸光度D260mm／D280mm＞1.80表明纯度高，可用于实验。

1.2.2 反转录反应 反应总体积10μL，总RNA 模板250ng～300ng，25mmol／L MgCl22μL，反转录反应缓冲液1μL，各10 mmol／L的dNTPs混 合 物1μL，RNA酶 抑 制 剂0.2 5μL，5 U／μL AMV 反转录酶0.5μL，Oligo dT Adaptor 0.5μL，以无RNA 酶的灭菌水补充体积至10μL，混匀后稍离心。PCR 仪上42 ℃反应30min，然后99 ℃加热5min，冰浴保存备用。

1.2.3 荧光定量PCR 引物序列由上海生物工程技术公司合成。反应总体积25μL。反应条件：95 ℃预变性4min；94 ℃变性15s，72 ℃延伸15s，40个循环，每一次循环后72 ℃采集荧光强度数据。65 ℃～94 ℃，每0.5 ℃读取一次制备溶解曲线。表达水平以目的基因与内参β－actin的比值表示。

1.2.4 颈动脉超声检查评价标准［1］根据斑块回声强度和形态特点，分为扁平斑、软斑、硬斑、溃疡斑4型，软斑和溃疡斑合称为不稳定斑块，余为稳定斑块。管腔直径狭窄百分比：狭窄程度＝（1－d／D）×100%（D：远端正常管腔直径，d：最小残端直径）；狭窄程度＞70%为重度狭窄。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两 组 外 周 血IL－6、IL－10、TNF－α mRNA 表 达 水 平 比 较

脑梗死组IL－6mRNA表达水平明显高于对照组（P ＜0.05），IL－10mRNA 表达水平明显低于对照组（P＜0.05）。详见表1。

表1 两组外周血IL－6、IL－10、TNF－α mRNA 表达水平

表1 两组外周血IL－6、IL－10、TNF－α mRNA 表达水平

组别 n IL－6 IL－10 TNF－α脑梗死组128 0.92±0.47 0.58±0.32 1.46±0.79对照组 65 0.69±0.32 0.78±0.51 1.39±0.87 P ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05

2.2 两组颈动脉斑块检出情况（见表2）

表2 两组颈动脉斑块检出情况 例（%）

2.3 脑梗死组中不同颈动脉斑块患者外周血IL－6、IL－10、TNF－αmRNA 表达水平比较 稳定斑块组IL－6mRNA、TNF－α mRNA 表 达 水 平 明 显 高 于 对 照 组，IL－10 mRNA 表 达水平明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表3。

表3 不同颈动脉斑块患者外周血IL－6、IL－10、TNF－αmRNA 表达

表3 不同颈动脉斑块患者外周血IL－6、IL－10、TNF－αmRNA 表达

组别 n IL－6 IL－10 TNF－α不稳定斑块组128 0.92±0.47 0.58±0.32 1.46±0.79稳定斑块组 65 0.69±0.32 0.78±0.51 1.39±0.87 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 讨 论

脑梗死最重要的病因和病理基础是动脉粥样硬化，目前认为，动脉粥样硬化的形成是一种炎症性病变的过程，并且炎症活动可以导致不稳定斑块以及血栓形成等，引起急性缺血性事件的发生。动脉粥样硬化是脂质沉积于动脉壁形成局部斑块的过程，炎症介质调控炎性细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的增殖效应，从而推动粥样硬化斑块病变的进展和斑块结构的改变［2］。颈动脉粥样硬化是脑卒中的重要危险因素，颈动脉粥样硬化斑块破裂、继发性血栓形成与炎症反应有密切的联系，因此认识颈动脉粥样硬化和炎症活动相关的基因表达水平与缺血性卒中的关系，有利于尽早采取干预措施，对脑梗死的预防及治疗有十分重要的临床意义。

IL－6是一种具有炎症调节和免疫调节作用的多功能细胞因子，在缺血性脑损伤的脑组织中显著增高、过度表达，可能参与继发性脑损伤的过程。IL－6可以刺激急性期反应蛋白合成增多，黏附分子表达增加，直接损伤血管内皮细胞和神经细胞，并促进凝血状态和血管收缩，使兴奋性氨基酸、一氧化氮释放量增加，加重脑组织水肿、神经细胞坏死和凋亡。国外学者Tuttolomondo等［3］通过研究显示，脑缺血后有明显的炎症反应存在，且IL－6的表达明显增加。IL－10是一种炎性抑制因子，Kucharzik等［4］研究发现，IL－10可抑制单核细胞趋化蛋白的表达，后者在动脉硬化过程中早期参与介导单核细胞的聚集。TNF－α是一种重要的机体炎症免疫应答调节因子，脑组织中神经元和星形胶质细胞均可产生TNF－α。TNF－α是脑梗死引起全身炎症反应综合征中的主要炎症介质，通过刺激或诱发多种细胞因子释放、激活内皮细胞，增加血管扩张、通透性增高；可以通过其激活作用在血管内皮细胞表面形成凝血活酶复合物，凝血酶原转化为凝血酶，使纤维蛋白原沉积于血管壁，导致动脉粥样硬化的发生［5］。

颈动脉粥样硬化造成管腔狭窄是脑梗死的独立危险因素，造成缺血性卒中的机制是斑块不断增大，直接阻塞血管；或狭窄的颈动脉使远端的灌注压下降，导致分水岭区供血不足，形成低灌注性梗死。因此，颈动脉斑块性质的监测和狭窄程度的评估，对预测缺血性脑卒中有着重要的意义。

本研究结果显示，急性脑梗死组炎症因子基因表达水平明显异常，颈动脉不稳定斑块、高度狭窄的比例明显升高，并且在不稳定斑块组中炎症因子基因表达水平尤为异常。表明IL－6、TNF－α作为促炎因子，IL－10作为抗炎因子，与脑梗死急性期的炎症反应、颈动脉斑块的不稳定性密切相关，在颈动脉粥样硬化的发生、发展中有重要作用，并可能与动脉硬化血栓形成存在因果关系。

外周血炎症因子基因表达水平的异常与颈动脉粥样硬化斑块的发生、发展及脑梗死密切相关，及时开展炎症介质的干预治疗可能为稳定颈动脉不稳定斑块、预防和治疗急性脑梗死开辟新的途径。

［1］ 何文.颈动脉彩色多普勒超声与临床［M］.北京：科学技术文献出版社，2007：11－64.

［2］ Frisdal E，Lesnik P，Olivier M，et al.Interleukin－6protect human macrophages from cellular cholesterol accumulation an attenuates the proinflammatory response［J］.J Biol Chem，2011，286（35）：30926－30936.

［3］ Tuttolomondo A，Di Raimondo D，Di Sciacca R，et al.Infalmmatory cytokines in acute ischemic stroke［J］.Curr Pharm Desl，2008，14（33）：3574－3589.

［4］ Kucharzik T，Lugering N，Pauels HG，et al.IL－4，IL－10and IL－13 down－regulate monocyte－chemoattracting protein－1production in activated intestinal cell［J］.Clin Exp Immunal，1998，111：152.

［5］ 高强，何成奇.脑梗死生化指标及其临床意义的国内研究进展［J］.中国康复医学杂志，2009，24（2）：190－192.