慢病毒介导的ATF5基因沉默及其对荷人卵巢癌裸鼠移植瘤增殖的影响

盖雪飞，谷 雪，丁朝霞，胡 明，王 斌，陈爱平，钱冬萌

(1青岛大学医学院附属医院，山东青岛266003;2青岛大学)

卵巢癌是目前病死率最高的妇科恶性肿瘤，居女性生殖系统三大恶性肿瘤之首，严重威胁女性的健康和生命［1］。人转录激活因子5(ATF5)是转录激活因子/cAMP应答元件结合蛋白家族的新成员，不仅参与细胞的生长、分化、应激、凋亡等，还参与肿瘤的发生［2～4］。RNA 干扰(RNAi)技术可以特异、高效、快速地抑制靶基因的表达，从而广泛用于基因治疗的研究［5］。2012年11月 ～2013年9月，我们利用ATF5-siRNA慢病毒载体，观察ATF5基因沉默对荷人卵巢癌裸鼠移植瘤增殖的影响，以期为卵巢癌的基因治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人卵巢癌细胞株SKOV3购于上海细胞库;SPF级BALB/C-nude雌性裸鼠30只购于北京维通利华，4～6周龄，体质量为15～18 g。ATF5-siRNA慢病毒载体购于上海吉凯基因公司，小鼠抗人β-actin单克隆抗体购于武汉博士德生物有限公司，TUNEL试剂盒购于Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 造模与分组处理 取对数生长期的人卵巢癌SKOV3细胞，经胰酶消化后，1 000 r/min离心10 mim。无血清培养基重悬，计数，调整细胞悬液密度为5×107/mL，每只裸鼠皮下注射100μL。注射7 d后，随机分为实验组、阴性对照组和空白对照组各10只。实验组瘤内注射ATF5-siRNA慢病毒100 μL/(只·次)，阴性对照组瘤内注射空载慢病毒100μL/(只·次)，空白对照组瘤内注射PBS 100 μL/(只·次)，隔天1次，共7次。

1.2.2 成瘤情况观察 观察裸鼠的一般情况，包括饮食、睡眠、活动状态等。每隔3 d用游标卡尺测量裸鼠皮下移植瘤的最长径及最短径，计算移植瘤的体积，并绘制移植瘤生长曲线。移植瘤体积(V)=0.523 6×长径×短径2。4周后处死裸鼠，取出移植瘤组织并称重，计算实验组抑瘤率。实验组抑瘤率=(空白对照组瘤重－实验组瘤重)/空白对照组瘤重×100%。

1.2.3 移植瘤组织 ATF5 mRNA检测 采用 RTPCR法。Trizol法提取总RNA，RNase处理后逆转录合成 cDNA。ATF5上游引物:5'-AAGTCGGCGGCTCTGAGGTA-3'，下 游 引 物:5'-GGACTCTGCCCGTTCCTTCA-3'，扩增长度:114 bp。内参基因βactin上游引物:5'-TGGAACGGTGAAGGTGACAG-3'，下游引物:5'-GGCTTTTAGGATGGCAAGGG-3'，扩增长度:154 bp。PCR反应条件:94℃预变性5 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共 30 个循环，72℃延伸10 min，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。UVP凝胶成像系统拍照，Quantity One软件进行灰度分析，计算ATF5 mRNA与内参基因的比值。

1.2.4 移植瘤组织ATF5蛋白检测 采用Western blot法。提取3组移植瘤组织总蛋白，进行蛋白定量，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶封闭，加入5%脱脂奶稀释的兔抗人ATF5多克隆抗体，室温孵育2 h，4℃过夜，TBST洗膜。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，室温孵育1 h，TBST洗膜。增强化学发光法(ECL)发光压片显色，以β-actin为参照蛋白，用Quantity One软件进行分析。

1.2.5 移植瘤组织凋亡检测 采用TUNEL法。将移植瘤组织制成石蜡切片，脱蜡、水合，细胞通透液处理组织8 min，加入TUNEL反应混合液50μL、convert-POD 50μL，最后加入 DAB底物50μL显色，中性树胶封片。400倍光学显微镜下随机选取5个视野，计数1 000个细胞中的凋亡细胞数;凋亡细胞核为棕黄色或棕褐色，其余为蓝色。凋亡指数(AI)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组成瘤情况比较 与阴性对照组和空白对照组相比，实验组移植瘤生长速度明显减慢，见插页Ⅲ图6。实验组瘤重(0.63±0.06)g，明显低于阴性对照组(1.14 ±0.07)g及空白对照组(1.25 ±0.08)g，P均＜0.01;阴性对照组与空白对照组比较，P＞0.05。实验组抑瘤率49.60%。

图6 3组移植瘤生长曲线

2.2 3组ATF5 mRNA及蛋白表达比较 实验组ATF5 mRNA及蛋白相对表达分别为0.40±0.09、0.46 ±0.05，阴性对照组分别为 0.67 ±0.07、0.72±0.03，空白对照组分别为 0.80 ± 0.07、0.82 ±0.05;实验组与阴性对照组、空白对照组比较，P均＜0.01;空白对照组与阴性对照组比较，P ＞0.05。见图 1、2。

2.3 3组移植瘤组织AI比较 实验组、阴性对照组、空白对照组移植瘤组织AI分别为34.63% ±1.91%、6.04% ±0.19%、5.07% ±0.20%，实验组与阴性对照组、空白对照组比较，P均＜0.01;阴性对照组与空白对照组比较，P＞0.05。

3 讨论

图1 3组ATF5 m RNA表达

图2 3组ATF5蛋白表达

卵巢癌的病死率位居妇科恶性肿瘤首位，尽管手术技巧的提高及顺铂、紫杉醇等化疗药物的临床应用为卵巢癌患者带来多重生机，但其5年生存率仍然停滞不前，主要原因是70%以上的卵巢癌诊断时病变已超出卵巢，属于晚期并对化疗耐药。随着分子生物学及基因学等基础医学的发展，与卵巢癌有关的新基因不断被发现，对这些基因的研究为卵巢癌的诊断和靶向治疗提供了许多新靶点［6，7］。ATF5在多种恶性肿瘤组织中高表达，包括神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等，而在正常组织中低表达或不表达［8］。RNAi是一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默［9］。

Angelastro等［10］通过逆转录病毒介导 ATF5靶向的siRNA转染胶质瘤细胞，引起胶质瘤细胞发生显著凋亡，而不引起正常脑细胞的凋亡。本研究结果显示，与阴性对照组及空白对照组相比，实验组移植瘤体积及重量均明显减少，其抑瘤率达49.60%。该结果表明，慢病毒介导的ATF5-siRNA可以直接感染移植瘤组织并抑制其增殖。本研究中，与阴性对照组及空白对照组相比，实验组移植瘤组织内ATF5 mRNA及蛋白相对表达均明显减低，说明慢病毒介导的ATF5-siRNA能抑制荷人卵巢癌裸鼠移植瘤中ATF5基因的表达;而实验组AI则明显升高，结合3组肿瘤生长曲线可知，ATF5能明显抑制荷人卵巢癌裸鼠移植瘤的生长并促进其凋亡。以上结果均与齐亚妮等［11］的研究结果一致。

综上所述，ATF5-siRNA慢病毒直接注射后可以成功感染移植瘤，导致ATF5 mRNA及蛋白表达的下降，从而抑制荷人卵巢癌裸鼠移植瘤的生长，并能诱导移植瘤组织内细胞的凋亡。因此，ATF5可能是卵巢癌基因治疗的有效靶点。这为ATF5作为靶基因，应用于卵巢癌的临床治疗提供理论依据。

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［11］齐亚妮，钱冬萌，芦进荣，等.沉默ATF5对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响［J］.中华肿瘤防治杂志，2012，6(11):822-826.