降钙素基因相关肽对滑膜来源间充质干细胞增殖与成骨分化的调控作用

王 浩，陈 森，马雨洪，姚惟琦

(1武昌医院，武汉430063;2武汉大学基础医学院)

骨组织为高度血管化的结缔组织，在体内一直处于持续的更新替代过程中。大块骨缺损、萎缩性骨不连和骨质疏松等诸多情况都需要大量骨组织［1］。临床上最常用的骨组织材料为同种异体骨或自体骨。同种异体骨移植有潜在的传染疾病和导致过敏的风险。同时，自体骨移植的骨量来源有限且会损害取骨部位。骨组织工程为解决临床上骨组织的需要带来了曙光。目前骨组织工程大部分是研究骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)。但是通过骨髓抽吸来获取骨髓来源的MSCs不仅会对人体带来巨大伤害，而且能够获取的细胞数目也十分有限。从不同组织获取的MSCs细胞具有不同的增殖和分化特性。最新的研究显示，滑膜来源MSCs(SMSCs)具有更强的增殖和成骨分化能力［2］。研究显示降钙素基因相关肽(CGRP)可能也参与了骨的代谢过程。在成骨细胞中过表达CGRP的转基因小鼠骨密度会增加而缺乏CGRP表达的小鼠会发生骨量减少［3］。本研究探讨了CGRP对SMSCs增殖与成骨分化的调控作用，为将CGRP干预后的细胞作为骨组织工程中的种子细胞，最终应用于体内环境下骨缺损的修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM培养基、F12培养基、胎牛血清(Gibco公司)，Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、10 mmol/L β-甘油磷酸、100 nmol/L地塞米松、0.1 mmol/L抗坏血酸、CGRP(Sigma公司)，一抗、辣根过氧化物酶偶联二抗(Santa Cruz公司)，TRIzol Reagent(Invitrogen公司)，RT-PCR试剂盒、Taq聚合酶、dNTP(MBI公司)，CCK-8增殖试剂盒(日本同仁)，IQ SYBR Green supermix(Bio-Rad公司)，碱性磷酸酶定量检测试剂盒(南京建成生物科技公司)，蛋白定量检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 SMSCs的分离、培养及鉴定 12周龄的SD大鼠均购自湖北中医药大学实验动物中心，所有的动物实验相关操作都通过了医院伦理委员会批准。麻醉状态下处死大鼠后，无菌条件下分离大鼠双侧膝关节内的滑膜组织，并用显微剪刀将滑膜组织剪成碎屑。PBS清洗数次后，用0.25%的胰酶在37℃条件下消化5 min，再用0.1%的Ⅱ型胶原酶在37℃条件下消化3 h。然后离心收获、培养基重悬细胞并用40 μm滤网过滤获得单细胞悬液。最后将细胞种植于25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱内培养，并标记为原代。以后每隔2 d换液1次，并于换液后在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态特征。待细胞接近融合时用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2的比例传代。SMSCs第1次传代培养后可见细胞呈双极或多极纺锤体样形状，细胞可贴壁并快速生长。传代后第3代细胞形态均一，呈纺锤体样形状。继续传代培养，细胞形态无明显改变。采用流式细胞仪检测第3代细胞表面标记，细胞的百分比CD13占93.3% ±1.4%，CD44占97.2% ±2.7%，CD105占94.6% ±2.2%。形态学和流式细胞术结果初步确定本实验中成功分离出SMSCs。

1.3 CGRP诱导SMSCs的增殖和成骨分化 选取第3代SMSCs细胞进行增殖和成骨分化实验。胰酶消化贴壁细胞后，以1.5×104/mL的密度接种细胞，第2天后换液。

增殖实验中细胞分两组，分别为对照组和实验组。其中对照组为普通DMEM/F12培养基，实验组为普通DMEM/F12培养基加10-8mol/L的CGRP。实验组和对照组分别每隔1 d换液1次。采用CCK-8法检测细胞活性。CGRP诱导SMSCs增殖0、2、4、6、8 d 后，消化细胞并将细胞以每孔 100 μL的体积加入96孔板中，然后每孔中再加入10 μL的CCK-8溶液。将培养板于孵育箱内避光孵育1 h后，在450 nm波长下检测每孔仪器上显示的吸光度值，最后再将吸光度值比转化为相应的细胞数目比。

成骨分化实验中细胞分两组，对照组为单纯成骨诱导液，实验组为成骨诱导液加10-8mol/L的CGRP。成骨诱导液成分为含10%胎牛血清的DMEM，10 mmol/L 的 β-甘油磷酸，100 nmol/L 的地塞米松，0.1 mmol/L抗坏血酸。实验组和对照组分别每隔1 d换液1次。CGRP诱导SMSCs成骨分化5、10 d后，收获成骨分化的细胞，并进行碱性磷酸酶活性定量检测。用碱性磷酸酶定量检测试剂盒进行检测，将细胞裂解，加入缓冲液震荡15 min。然后加入碱性磷酸酶底物反应30 min，最后加入0.05 mol/L的氢氧化钠终止反应。测量405 nm处的吸光度值。用蛋白定量试剂盒进行蛋白定量检测。测定的吸光度值与相应蛋白定量的比值即为标准化的碱性磷酸酶活性(OD值/mg蛋白/30 min)。

采用RT-PCR法对SMSCs细胞内增殖相关基因〔细胞周期素D1(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(PCNA)〕和成骨分化相关基因〔Runx2、骨形态发生蛋白2(BMP-2)〕表达水平进行检测。收集CGRP诱导增殖后7 d和成骨分化后7 d的细胞，并使用TRIzol分别提取各组细胞的总RNA，按逆转录试剂盒的操作步骤逆转录得到cDNA，并选取逆转录产物进行实时荧光定量RT-PCR。引物标记采用荧光染料SYBR GreenⅠ。Cyclin D1引物序列:上游5＇-TGCGTGCAGAGGGAGATTGT-3＇，下游 5＇-GCGGATAGAGTTGTCAGTGTAGATG-3＇;PCNA 引物序列:上游 5＇-AAGGGCTGAAGATAATGCTGATAC-3＇，下 游5＇-CATATACGTGCAAATTCACCAGAT-3＇;Runx2 引物序列:上游 5＇-CCAGATGGGACTGTGGTTACTG-3＇，下游 5＇-TTCCGGAGCTCAGCAGAATAA-3＇;BMP-2 引物序列:上游 5＇-GCCCTTTTCCTCTGGCTGAT-3＇，下游 5＇-TTGACCAACGTCTGAACAATGG-3＇;GAPDH 引物序列:上游 5＇-TATGACTCTACCCACGGCAAGT-3＇，下游 5＇-ATACTCAGCACCAGCATCACC-3＇。反应结束后在PCR仪上读取Ct值，并通过计算机软件进行相应计算，得出基因的相对表达量，以GAPDH为内参。

1.4 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较用成组t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

CGRP诱导SMSCs增殖第0天实验组、对照组细胞数目比分别为1、1;第2天分别为1.14±0.03、1.25±0.05，两组比较P＞0.05;第4天分别为1.34±0.08、1.40±0.07，两组比较 P ＜0.05;第 6天分别为1.76±0.12、1.89±0.14，两组比较 P ＜0.05;第8天分别为1.84±0.13、2.35±018，两组比较P＜0.05。CGRP诱导SMSCs成骨分化第5天实验组、对照组碱性磷酸酶活性分别为1.38±0.05、1.00±0.02，第 10天分别为 1.75±0.10、1.44±0.06，两组比较P 均 ＜0.05。两组Cyclin D1、PCNA、Runx2、BMP-2基因表达水平比较结果见表1。

表1 两组 Cyclin D1、PCNA、Runx2、BMP-2基因表达水平比较(±s)

表1 两组 Cyclin D1、PCNA、Runx2、BMP-2基因表达水平比较(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05

Cyclin D1 PCNA BMP-2 Runx2实验组 2.23±0.08* 3.38±0.50* 2.81±0.12* 1.67±0.10组别*对照组1.46±0.07 1.74±0.12 1.92±0.08 1.12±0.05

3 讨论

骨组织工程可以为临床上因创伤、骨肿瘤或骨先天发育畸形等情况导致的大量骨缺损提供足量且安全的骨组织［4，5］。骨组织工程的研究中，大部分的研究重点都集中于骨髓来源的 MSCs［6，7］。但是关于SMSCs研究一直相对不足。最近的研究显示，SMSCs相对于其他组织来源的MSCs而言，具有更强的增殖和成骨分化潜能，这使得SMSCs成为新的研究热点［8］。Lee 等［9］学者进一步研究显示，联合应用SMSCs和富含血小板的血浆能够显著修复兔动物模型中的骨软骨缺损。Moriguchi等［10］研究表明以SMSCs为种子细胞并利用无支架技术体外构建组织工程团块能够修复猪模型中半月板的缺损，可有望用于抑制半月板的退变和延缓创伤性关节炎的发展。CGRP对骨细胞特别是成骨细胞的作用近年来受到广泛关注。Tian等［11］研究表明，CGRP能够显著促进人成骨样细胞中BMP-2的表达和增殖，也能够促进去成骨分化相关基因如碱性磷酸酶、骨钙素等的表达。也有研究显示CGRP可以促进成骨细胞的增殖，且过表达CGRP基因的小鼠骨量会发生明显上调。通过静脉注射CGRP能够显著预防因卵巢切除而导致的雌性大鼠骨量丢失［12］。

实验中我们发现，CGRP可以显著促进SMSCs细胞的增殖和分化。CCK-8法检测显示CGRP可以促进SMSCs细胞的增殖，碱性磷酸酶活性定量结果显示CGRP可以促进SMSCs细胞的成骨分化。我们进一步利用RT-PCR对SMSCs细胞内增殖和成骨分化相关基因表达水平进行检测。结果表明CGRP可以促进SMSCs细胞中增殖相关基因Cyclin D1和PCNA的表达，成骨分化相关基因BMP-2和Runx2的表达。其中Cyclin D1在调节细胞周期中十分关键，其激活能够促进细胞增殖且其过度激活是许多肿瘤细胞的特征，对肿瘤的诊断和预后判断也有积极的意义［13］。PCNA在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标［14］。BMP-2为TGF-β超家族细胞因子的成员之一，它在MSCs成骨分化过程中起到了重要的作用，BMP-2能够显著促进MSCs的成骨分化［15］。Runx2的另一个名称为Cbfα1，它是间充质干成骨分化过程早期关键的转录因子之一［16］。我们的实验结果初步表明，CGRP在调控SMSCs的增殖和成骨分化过程中发挥着十分关键的作用。但CGRP如何促进SMSCs细胞增殖和分化的具体分子机制依然有待进一步的实验研究。我们初步推测CGRP可能通过激活经典的Wnt通路并抑制细胞凋亡来达到促进SMSCs细胞增殖和成骨分化的效果，CGRP也有可能通过OPG/RANKL/RANK分子轴来达到促进SMSCs增殖和成骨分化。

本实验中成功分离出SMSCs细胞，并进一步证实CGRP可以促进SMSCs细胞的增殖和成骨分化。

［1］Dimitriou R，Jones E，McGonagle D，et al.Bone regeneration:current concepts and future directions［J］.BMC Med，2011，(9):66.

［2］Yoshimura H，Muneta T，Nimura A，et al.Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow，synovium，periosteum，adipose tissue，and muscle［J］.Cell Tissue Res，2007，327(3):449-462.

［3］Schinke T，Liese S，Priemel M，et al.Decreased bone formation and osteopenia in mice lacking alpha-calcitonin gene-related peptide［J］.J Bone Miner Res，2004，19(12):2049-2056.

［4］Rosset P，Deschaseaux F，Layrolle P.Cell therapy for bone repair［J］.Orthop Traumatol Surg Res，2014，100(1 Suppl):107-112.

［5］Samavedi S，Whittington AR，Goldstein AS.Calcium phosphate ceramics in bone tissue engineering:a review of properties and their influence on cell behavior［J］.Acta Biomater，2013，9(9):8037-8045.

［6］安伟德，胡祥，曹亮，等.骨髓间充质干细胞定向分化肝细胞及肝内移植研究［J］.中华实验外科杂志，2005，22(8):917-919，1026.

［7］吴永超，郑启新，谢宗平，等.骨髓间充质干细胞表达神经营养因子及治疗脊髓损伤的研究［J］.中华实验外科杂志，2005，22(2):139-141.

［8］Chang CH，Chen CC，Liao CH，et al.Human acellular cartilage matrix powders as a biological scaffold for cartilage tissue engineering with synovium-derived mesenchymal stem cells［J］.J Biomed Mater Res A，2013.

［9］Lee JC，Min HJ，Park HJ，et al.Synovial membrane-derived mesenchymal stem cells supported by platelet-rich plasma can repair osteochondral defects in a rabbit model［J］.Arthroscopy，2013，29(6):1034-1046.

［10］Moriguchi Y，Tateishi K，Ando W，et al.Repair of meniscal lesions using a scaffold-free tissue-engineered construct derived from allogenic synovial MSCs in a miniature swine model［J］.Biomaterials，2013，34(9):2185-2193.

［11］Tian G，Zhang G，Tan YH.Calcitonin gene-related peptide stimulates BMP-2 expression and the differentiation of human osteoblastlike cells in vitro［J］.Acta Pharmacol Sin，2013，34(11):1467-1474.

［12］Valentijn K，Gutow AP，Troiano N，et al.Effects of calcitonin gene-related peptide on bone turnover in ovariectomized rats［J］.Bone，1997，21(3):269-274.

［13］Yan GJ，Yu F，Wang B，et al.MicroRNA miR-302 inhibits the tumorigenicity of endometrial cancer cells by suppression of Cyclin D1 and CDK1［J］.Cancer Lett，2014，345(1):39-47.

［14］Madhumati G，Kavita S，Anju M，et al.Immunohistochemical Expression of Cell Proliferating Nuclear Antigen(PCNA)and p53 Protein in Cervical Cancer［J］.J Obstet Gynaecol India，2012，62(5):557-561.

［15］Madl CM，Mehta M，Duda GN，et al.Presentation of BMP-2 mimicking peptides in 3D hydrogels directs cell fate commitment in osteoblasts and mesenchymal stem cells［J］.Biomacromolecules，2014，15(2):445-455.

［16］Song I，Kim K，Kim JH，et al.GATA4 negatively regulates osteoblast differentiation by downregulation of Runx2［J］.BMB Rep，2013.