白首乌C21甾体苷对Heps小鼠抑瘤作用和对造血功能影响

王冬艳，华 欣，叶记林，李晶晶，李 芹，严慧深

(1.扬州职业大学医学院，2.江苏省苏北人民医院，江苏扬州，225009)

常用中药白首乌，使用历史悠久，其主要来源有3种:耳叶牛皮消(Cynanchum.auriculatum Royle ex Wight)、泰山白首乌(Cynanchum bungei Decne)、隔山消［Cynanchum.wilfoldii(Maxim)Hemsl)］。现常用的白首乌药材的植物为耳叶牛皮消，主产于江苏，为地产道地药材，多为栽培。耳叶牛皮消根茎的醇提物在体内外有抗肿瘤活性，其对人肿瘤细胞系 K562、SHG44、HCT-8、A549和PC3及对小鼠移植性肉瘤S180都有抑制作用［1］。C21甾体苷是白首乌中公认的主要活性成分［2］，具有抗肿瘤、增强免疫、抗衰老、保肝护肝等药理作用，其中白首乌苷可阻止肝癌细胞DNA合成［3］，从而发挥抗肿瘤作用。白首乌C21甾体酯苷对正常及免疫抑制动物均有明显的免疫增强作用，可使小鼠胸腺和脾脏不因受免疫抑制剂而萎缩，对免疫器官具有一定的保护作用［4］。本实验建立了移植性肿瘤模型，观察C21甾体苷联合化疗后的肿瘤抑制作用和对骨髓造血的影响。

1 材料与方法

1.1 药品和主要试剂

白首乌C21甾体苷由中国药科大学提供;环磷酰胺(CTX)，为上海华联制药公司产品;羧甲基纤维素，由Sigma公司提供;AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒，为瑞士罗氏公司产品;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 动物与瘤株

清洁级ICR小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，由扬州大学实验动物中心提供，合格证号:SYXK 2002—0045。肝癌实体型Heps:由中科院上海药物研究所提供，江苏省肿瘤防治研究所药物研究室传代保种。

1.3 主要设备及仪器

LABCONCO超纯水机:上海和杰科技控股有限公司;AIR-TECH超净工作台:苏州净化集团安泰公司;BP11OS电子天秤:德国SARTORIUS公司;医用解剖器械:苏州医疗器械厂;全自动血液分析仪SYSMEX xs-800i:希森美康医用电子公司生产;流式细胞仪:美国BD公司产品。

1.4 模型制备及动物分组和给药

参照移植性肿瘤研究方法［5］:无菌条件下抽取传代第8 d荷瘤小鼠的腹水，以无菌生理盐水稀释，调整细胞浓度在1.0×107/mL，每鼠于右前肢皮下接种0.2 mL。接种24 h后小鼠称重随机分为正常对照组、模型对照组(1%羧甲基纤维素钠溶液)、白首乌C21甾体苷20 mg/kg剂量组、化疗组(环磷酰胺)和联合组(环磷酰胺+白首乌C21甾体苷)，每组12只，组间平均体质量差异不超过1 g，灌胃给药0.2 mL/10 g，1次/d。

1.5 体质量和抑瘤率的测定

末次给药24 h后脱颈椎处死小鼠，解剖剥离肿瘤称重，依据公式:抑瘤率=(1－实验组平均瘤质量/阴性对照组平均瘤质量)×100%。

1.6 外周血常规检测

第14天各组小鼠经摘除眼球采血后，用血液分析仪分别计数外周血白细胞数、红细胞数、血小板数［6］。

1.7 骨髓有核细胞计数

将各组小鼠脱臼处死，取完整右侧股骨，用磷酸盐缓冲液反复冲洗骨髓腔，收集全部骨髓形成单核细胞悬液，血球计数板计数，计算出每根骨髓含有的有核细胞数［7］。

1.8 流式细胞术检测骨髓细胞凋亡率

取1×106个骨髓细胞，参照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒方法处理后，采用流式细胞仪检测。以未染色细胞调零，以Annexin V-FITC单染管和PI单染管作为基准参照，测定每个上样管数据。

1.9 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行分析，数据处理用均数±标准差±s)表示，组间比较用t检验，多组间比较用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对小鼠体质量及抑瘤率的作用

各组小鼠均在接种后3～5 d内出现可触及的瘤结节，并呈进行性增大。实验过程中无肿瘤消退，个别动物死亡，立即解剖肉眼观察未见明显病理改变。重复3批实验抑瘤效果稳定。化疗组小鼠体质量较正常组和模型组均明显下降，与白首乌组和联合治疗组比较亦有显著差异。对肝癌实体型Heps各用药组均显示较强的抑制作用，白首乌组为37.74%，化疗组抑瘤率为60.24%，联合治疗组抑瘤率为59.67%，化疗组与白首乌组比较差异有有统计学意义(P＜0.05)，与联合治疗组比较无差异。初步说明白首乌C21甾体苷具有对肝癌实体型Heps的抑制作用，作用不及环磷酰胺，并且无合用增加抑制作用，但白首乌能改善化疗带来的体质量下降。见表1。

2.2 外周血常规比较

与正常对照组相比，模型组的外周血白细胞数、红细胞数、血小板数均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)，表明荷瘤后降低小鼠外周血常规显著降低;与模型对照组相比，化疗组的白细胞下降明显;与化疗组相比白首乌组能明显增加白细胞、红细胞和血红蛋白的量，血小板的改变不明显;联合用药后，白首乌能改善环磷酰胺的白细胞和血红蛋白的减少。说明白首乌C21甾体苷能改善化疗带来的血象抑制作用。见表2。

表1 对小鼠体质量影响和抑瘤作用比较±s，n=10)

表1 对小鼠体质量影响和抑瘤作用比较±s，n=10)

与正常组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，△△P＜0.01;与化疗组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

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表2 对小鼠体质量影响和抑瘤作用比较±s，n=10)

表2 对小鼠体质量影响和抑瘤作用比较±s，n=10)

与正常组比较，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与化疗组比较，#P＜0.05，##P ＜0.01。

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2.3 对小鼠骨髓细胞计数和骨髓细胞凋亡的影响

结果如表3和图1所示，与正常组比较，荷瘤小鼠骨髓细胞计数和凋亡率均有明显差异(右侧2个象限细胞数之和代表凋亡细胞数);骨髓细胞计数白首乌组和联合治疗组均较环磷酰胺组明显上升;骨髓细胞凋亡率环磷酰胺为(23.20±4.16)%，比模型组(6.50 ±5.93)%明显上升，而白首乌组和联合治疗组的骨髓细胞凋亡均较环磷酰胺组有明显下降。说明白首乌C21甾体苷能降低环磷酰胺化疗带来的骨髓抑制作用。

表3 骨髓细胞计数和对小鼠凋亡率的比较±s，n=10)

表3 骨髓细胞计数和对小鼠凋亡率的比较±s，n=10)

与正常组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05，△△P ＜0.01;与化疗组比较，##P ＜0.01。

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图1 小鼠骨髓细胞凋亡流式图

3 讨论

恶性肿瘤的治疗包括手术、放疗及化疗等，但在治疗过程中会对机体的正常组织及细胞产生强烈的杀伤作用。目前，化疗药物仍存在毒副反应大等问题，化疗可致外周血常规全面降低，又加重了感染、出血等风险，导致机体免疫失衡，甚至危及生命。近年来，天然抗癌药物成为世界新药研发的热点［8］，中药抗肿瘤研究日益受到重视［9－10］，中药及其有效成分抗肿瘤作用的研究得到世界范围的重视［11－12］。

环磷酰胺属于烷化剂类细胞毒药物，是临床上常用的广谱细胞周期非特异性化疗药，对增殖周期中的各期细胞均有较强的杀灭作用，但治疗同时易产生一系列毒副作用，多表现为中枢神经系统毒性及骨髓抑制，高剂量时亦常见恶心呕吐。因此，在强调杀伤肿瘤细胞同时，保护骨髓造血功能已成为影响化疗疗效的重要因素和后续化疗能否顺利进行的重要保障。中医药以疗效确切、毒副反应少、价格低廉等优点成为当前防治骨髓抑制的研究热点，且中药配合放射治疗、化学治疗(化疗)具有减毒增效作用［13］。

已有实验证明，C21甾体苷能抑制肝癌Heps，诱导肿瘤细胞凋亡［14］，增强荷瘤小鼠的免疫功能［15］。本实验中对肝癌实体型Heps各用药组均显示较强的抑制作用，白首乌组的肿瘤抑制作用不及化疗组，但体质量下降和小鼠生存状态上表现了中药抗肿瘤的优势。血象反映出机体造血系统的功能状态，荷瘤后小鼠外周血象降低，白首乌C21甾体苷能改善荷瘤小鼠外周血象，与环磷酰胺联合用药后，白首乌能改善化疗后小鼠的白细胞和血红蛋白的减少。荷瘤小鼠骨髓细胞计数减少和凋亡率上升，使用化疗药物后骨髓抑制更严重，而白首乌C21甾体苷能改善荷瘤和化疗后骨髓抑制状态。本实验结果表明，白首乌C21甾体苷具有抗肝癌Heps活性，其抑瘤作用虽弱于环磷酰胺，但可促进骨髓增殖，与化疗药合用可减轻化疗的骨髓抑制作用。

［1］Shan L，Zhang W D，Zhang C，et al.Antitumor activity of crude extract and fractions from root tuber of Cynanchum auriculatum Royle ex Wight［J］.Phytotherapy Research，2005，19(3):259.

［2］张如松，叶益萍，沈月毛，等.白首乌体外抑制肿瘤细胞的成分研究［J］.药学学报，2000，35(6):431.

［3］贾翎，顾立刚，赵建晴，等.白首乌甙对DEN诱发实验性肝癌大鼠肝细胞DNA含量和细胞周期变化的影响［J］.北京针灸骨伤学院学，2001，8(1):3.

［4］宋俊梅，王增，丁霄霖.白首乌总甙对小鼠免疫功能的影响［J］.轻工大学学报，2001，20(6):588.

［5］徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2002:1766.

［6］黄茜，祝彼得，石娅萍，等.八珍汤对骨髓损伤小鼠脾脏指数外周血象及骨髓造血组织面积影响的实验研究［J］.现代医药卫生，2012，28(8):1123.

［7］郭毅峻，金长娟，沙慧芳.七叶灵颗粒对骨髓抑制小鼠造血系统的影响［J］.医药导报，2012，31(12):1547.

［8］陈海琳，张福鹏，周永明.骨髓造血微环境及中药调控作用研究进展［J］.中成药，2010，12(7):1183.

［9］富琦，罗晓琴，唐勇，等.鸡血藤提取物体内抗肿瘤效应及对造血功能的影响［J］.中国中医药信息杂志，2008，15(12):29.

［10］张跃强，蒋士卿.八珍汤加减防治化疗后骨髓抑制135例［J］.河南中医，2007，27(7):66.

［11］Zhangs，YangX，Morris M E.Morris flavonoids are inhibitors of breast cancer resistance protein(ABCGZ)2-mediated transport［J］.Molpharmacol，2004，65(5):1208.

［12］Kim S W，Kwon H Y，Chi D W，et al.Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by ginsenosideRG(3)［J］.Biochem pharmalcol，2003，65(1):75.

［13］金己焕，徐振哗.中医药对化疗减毒增效的研究进展［J］.光明中医，2011，26(4):645.

［14］王冬艳，张洪泉，李心.白首乌C21甾体苷对肿瘤细胞凋亡的作用及机制［J］.药学学报，2007，42(4):366.

［15］王冬艳，李心，张洪泉.江苏地产白首乌C21甾体苷对荷瘤小鼠的免疫保护作用［J］.中国临床药理学与治疗学，2007，12(2):168.