人呼吸道合胞病毒Long株的免疫原性初探

李华 杨婷 岳磊 刘正玲 姜广菊 龙润乡 杨 蓉 罗芳宇 谢忠平

人类呼吸道合胞病毒(human respiratory virus，HRSV)是世界范围内婴幼儿病毒性下呼吸道感染最重要的病原体，尤见于婴幼儿、老年人及免疫缺陷病人等急性呼吸道感染住院者[1]。据估计，每年在世界范围内有3400万～6500万的呼吸道合胞病毒感染病例和16.0万～19.9万死亡病例[2]，仅在美国，呼吸道合胞病毒导致每年住院大约12.5万例[3]。在发展中国家，RSV在婴幼儿引起急性下呼吸道感染的病死率比较高[4]。由于该病毒的高感染率，在1岁前近70%的儿童就被首次感染，更重要的是，2岁以下婴儿大约36%至少感染两次[2，5]。从1956年Morris等首次发现该病毒至今，RSV感染引起的社会经济负担实际上比季节性流感更加严重，给国家和个人带来极大的损失[6]。

虽然HRSV疫苗的研究已有50多年的历史，但至今尚无被批准使用的产品。因此，WHO已将呼吸道合胞病毒疫苗列为21世纪需要优先解决的问题之一。由于HRSV自然感染激发的机体免疫是不完全免疫，需再次或多次的HRSV感染才能完善，疫苗需要多次给药才能达到保护严重下呼吸道感染的免疫水平。因此，获得免疫原性高的病毒株，才能为后续制备RSV单克隆抗体及裂解疫苗的研究打下基础。鉴于RSV感染后，T细胞亚群、细胞因子在致病和抗病中有着重要的作用。对Th1/Th2细胞因子的研究，在RSV疫苗及治疗药物方面有着积极意义。至今对RSV的研究已经涉及很多方面，但对RSV A亚型Long株免疫原性的基础研究还未见报道，现将结果报道如下。

材料与方法

1.材料:(1)细胞和病毒:Hep-2细胞、KMB17细胞由本所质量检定室提供;RSV Long株购于中国典型培养物保藏中心。(2)主要仪器和试剂:BD FACSCantoⅡ流式细胞仪为BD公司产品;酶联免疫分析仪/多功能生物检测仪为美国BIOTEK公司产品;BIO-RAD Chemi DocTMImaging System为美国BIO-RAD公司产品;一抗:兔抗RSV IgG为美国IMGENEX公司产品;羊抗兔-HRP为abcam公司产品;Al(OH)3佐剂(浓度为2.0mg/ml)为本所甲肝疫苗生产室自制;BDTMCytometric Bead Array(CBA)Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit(lot:3072948)，购于BD公司;化学发光底物:ImmobilonTMWestern Chemiluminecent HRP Substrate(lot:1131801)，购于Millipore公司。(3)实验动物:清洁级ICR(Institute of Cancer Research)小鼠，4周龄，雌雄各半，体重16～18g，由笔者单位灵长类中心小动物部提供，实验动物合格证号:SYXK(滇)2010007。

2.方法:(1)实验性疫苗制备:取生长状态良好的致密单层Hep-2细胞，培养并收获病毒;初纯、超滤浓缩;选择Sepharose 4FF凝胶[8]纯化，用双抗体夹心法检测RSV抗原含量，将RSV抗原含量高的不同收集样品合并即为纯化的HRSV样品，合并的样品用30kDa的超滤离心管，4000r/min，20min离心浓缩。纯化HRSV加Al(OH)3或不加Al(OH)3制备成为实验组样品。(2)纯化产物的检测:不同纯化收集的产物经SDS-PAGE电泳;浓缩后样品用蛋白检测试剂盒PierceTMBCA Protein Assay Kit检测蛋白含量，具体方法见试剂盒说明书;Western blot法鉴定 SDS-PAGE电泳，半干转印至PDVF膜上，以5%脱脂奶粉37℃封闭1h后，加一抗(兔抗RSV IgG多克隆抗体，浓度1∶500)4℃过夜、加二抗(羊抗兔IgG-HRP 1∶500)37℃反应1h，化学发光底物曝光显影。(3)免疫原性评价:选取ICR小鼠40只，随机分为4组，每组10只。2组实验性样品:纯化HRSV组[无Al(OH)3佐剂]、纯化HRSV+Al(OH)3佐剂组[Al(OH)3使用浓度为1.0mg/ml];同时设两个对照组:0.01mol/L PBS(pH 7.4)对照组、Al(OH)3对照组[0.01mol/L PBS(pH 7.4)配制的1.0mg/ml Al(OH)3佐剂]。免疫注射剂量:每只0.5ml，腹腔注射。免疫程序:分别于0天、28天免疫，共免疫2次，于初免后28天、加强后7天采血分离血清，检测血清中和抗体效价及IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF、IL-17A、IL-10 共 7 种细胞因子。(4)血清中和抗体效价检测:采用固定病毒稀释血清的微量中和试验法来检测血清中和抗体效价。待测血清56℃灭活30min后，做2倍系列稀释，每稀释度50微升/孔，再加入2000 CCID50/ml病毒50微升/孔，混匀，37℃中和1h后，加入1×106/ml浓度的Hep-2细胞100微升/孔。置37℃、4%CO2孵箱中培养。同时设置病毒对照、细胞对照和阴性血清对照。于第7天判定结果。以抗体效价≥1∶4为阳性。(5)血清细胞因子的检测:用BD公司BDTMCytometric Bead Array(CBA)Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit，流式细胞仪检测小鼠血清中的IL-2等7种细胞因子。具体方法见试剂盒说明书。

3.统计学方法:使用SPSS 13.0软件进行数据的统计分析。分别对组间进行比较，对于不满足正态分布的，采用非参数检验的方法进行比较;满足正态分布且方差齐性，采用两独立样本的t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.Sepharose 4FF凝胶过滤层析法纯化样品:收获病毒液感染性效价为6.125lgCCID50/ml，抗原效价为1∶64，纯化得率为44.4%。Sepharose 4FF凝胶过滤纯化曲线 (图1)。

图1 Sepharose 4FF凝胶过滤层析法纯化样品的纯化曲线

2.SDS-PAGE电泳和Western blot:经检测RSV抗原含量高的样品合并，用50kDa的离心管离心浓缩，即为实验样品，SDS-PAGE电泳，Bio-Rad的Quantity One软件分析表明，纯度达95%以上。Western blot检测，可见为3个条带:G蛋白90kDa、F蛋白55kDa及N蛋白46kDa(图2)。用蛋白检测试剂盒检测蛋白含量为3.66mg/ml。

图2 Sepharose 4FF凝胶过滤层析法纯化样品的SDS-PAGE和Western blot结果

3.HRSV纯化样品的中和抗体:将样品合并浓缩后，加Al(OH)3或不加Al(OH)3制备成实验性样品。经免疫程序(一免1针或二免2针)免疫ICR小鼠，每组10只，每只腹腔注射0.5ml实验性样品。分别于一免后28天，加强免疫后7天，采血，分离血清检测中和抗体效价(表1)，一免后，加Al(OH)3样品组与无Al(OH)3样品组的抗体阳转率分别为60%和50%，抗体效价分别为1∶4.49及1∶5.27，两组间抗体阳转率及GMT值均无统计学差异(P=0.409)。二免后2个实验组抗体阳转率均升高为100%，GMT分别为1∶17.15及1∶10.56，均有明显增高，与一免后结果相比差异有统计学意义(P＜0.01)，但Al(OH)3样品组与无佐剂病毒抗原组之间无统计学差异(P=0.220)。

表1 HRSV Long株纯化样品免疫ICR小鼠中和抗体效价

4.血清中细胞因子检测:用BD公司Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit检测小鼠血清，小鼠血清中的IL-2、IL-4、IL-6、IFN- γ、TNF、IL-17A、IL-10共7种细胞因子仅IL-6及TNF 2种细胞因子显著上升，其余5种皆无表达(图3、图4)。纯化HRSV+Al(OH)3组、纯化 HRSV组、Al(OH)3对照组与0.01mol/L PBS对照组共4个组，一免与二免(组内)、加Al(OH)3与不加Al(OH)3样品组(组间)之间，其细胞因子IL-6、TNF两种细胞因子组间皆有统计学差异(P＜0.05，表2)。

表2 不同免疫组IL-6与TNF两种细胞因子含量

讨 论

针对传染病及流行病的预防，传统经典疫苗是主要的研究方向，所以应获得代表国内流行的病毒株，且应能在体外高效增殖、遗传稳定性高、免疫原性好的优势毒株，所以本实验对HRSV Long株进行免疫原性初步探索。

将纯化蛋白加入Al(OH)3或不加入Al(OH)3佐剂制备为实验样品组，免疫ICR小鼠，病毒中和试验结果表明，第1次免疫后抗体阳转率达60%及50%，加强免疫后，抗体阳转率皆达100%，抗体几何平均效价(GMT)分别为1∶17.15和1∶10.56，平均增长3.8倍和2.0倍，但一免及二免后中和抗体铝佐剂组与无佐剂组GMT差异皆无统计学意义。抗体水平显著升高，但是效价较低，这与文献[7]报道的RSV A2株的免疫结果相符。实验虽然不是同一病毒株，但都属于A亚型，究其原因:是否由于RSV病毒是有包膜的病毒，经过病毒的初纯、超滤浓缩、凝胶纯化及再浓缩(超滤离心)一系列处理对病毒的影响所导致。

图3 纯化HRSV Long株免疫小鼠不同组别IL-6含量

图4 纯化RSV Long株免疫小鼠不同组别TNF含量

另一个原因是否由于该毒株的生物学特性及基因编码与其他病毒的具体差异所致，在获得RSV Long株后，对病毒株扩大培养至第5代，并进行RTPCR扩增病毒的F基因、G基因及N基因，将测序结果进行比对(比对株GenBank登录号:AY911262.1):RSV-N蛋白核苷酸同源性为97.48%，RSV-F蛋白为94.01%，RSV-G蛋白为99.78%。该毒株的F蛋白同源性较G蛋白低，与文献[8]报道不一致，但都大于90.00%，同源性的差异是否与血清效价有直接关系，有待进一步实验。

20世纪60年代研制的甲醛灭活疫苗(F1-RSV)的研究发现，HRSV灭活疫苗具有疾病加强作用，可能原因是破坏了小鼠辅助性T细胞Th1和Th2亚群动态平衡状态[9]。本次研究小鼠血清的细胞因子实验结果显示，仅有IL-6及TNF2种细胞因子升高，而IFN-γ、IL-4、IL-2皆未升高。实验中 Al(OH)3佐剂的使用，主要于注射位点的沉积，诱导动物模型的Th2型免疫应答，但结果显示佐剂的使用并未显著增加HRSV的免疫效果，所产生的抗体与无佐剂组无显著差异[10]。所以该RSV Long株所诱导的免疫是平衡的，未见明显的疾病加强指标。

另外，IL-6及TNF 2种细胞因子的升高，是否可以从以下得到解释:Levitz等[11]报道无论是在体内和体外，IL-6促炎细胞因子是宿主对呼吸道合胞病毒感染的反应产物。Pribul等[12]发现肺部早期趋化因子分泌的峰值是由巨噬细胞驱动，肺泡巨噬细胞受激活导致大量促炎症细胞因子的产生包括MIP1α、TNF-α、IL-6、IL-8。实验所检测的IL-6及TNF2种细胞因子升高，是否由于肺泡巨噬细胞激活所致尚待进一步证实。Choi等[13]报道肿瘤坏死因子(TNF)与儿童呼吸道感染RSV引起嗜酸性粒细胞炎症有关。研究还发现，人外周血多形核颗粒细胞(PMN)感染RSV后可分泌IL-6且IL-6的含量与接触病毒的数量有密切关系，Grell等报道的IL-6的产生呈现年龄依赖性，即年龄越小的动物越容易产生。

综上所述，如何在保持免疫原性的基础上，使RSV病毒样品能诱导平衡的Th1/Th2反应，增加疫苗的安全性，是RSV疫苗研究的关键。本实验初步探讨了RSV Long株抗原的免疫原性，从实验结果分析，本研究所制备的HRSV能诱导产生明显的体液免疫及细胞免疫，为进一步系统研究HRSV疫苗提供了实验资料。

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