鬼针草总黄酮对小鼠急性肝损伤的影响

孙海燕,付庆云,王朝辉,陈颖

（1.河南科技学院,河南新乡453003；2.新乡医学院第一附属医院检验科,河南卫辉453100）

鬼针草（Bidens bipinnata L.）属菊科鬼针草属（Bidens L.）,是以黄酮类为主要活性成分的食药两用植物[1].始载于《本草拾遗》,主治心血管疾病、肝炎、急性肾炎等[2-3].研究发现,鬼针草全草总黄酮（total flavones of Bidens bipinnata L.,TFB）是治疗小鼠急性肝损伤的有效成分[4-6].但鬼针草TFB在不同生理部位含量及组成差异较大[7-8].鉴于鬼针草不同部位的TFB对急性肝损伤保护作用的研究还未见报道,故本试验采用正交试验高效提取鬼针草各部位的TFB,利用CCl4制备急性肝损伤小鼠模型,观察血清中丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase,AST）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的变化,以明确其保肝作用及有效部位,旨在为鬼针草的有效开发提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 昆明小鼠,SPF级,雌雄各半,体质量18~20 g,购于新乡医学院实验动物中心,动物使用许可证号SYXK（豫）2010-0042.

1.1.2 药物与试剂 鬼针草采于河南新乡凤凰山,由河南科技学院植物学教研室孟丽教授鉴定；TFB由河南科技学院生物技术教研室制备；ALT、AST和LDH试剂盒（批号分别为R401BCA,R401B1A,R305ACA）购自上海蓝怡科技有限公司；芦丁标准品（批号A0103）购于成都曼斯特生物科技有限公司；CCl4（批号20120815）购于杭州辉煌化工有限公司.

1.1.3 试验仪器 AU2700全自动生化分析仪（Olympus）,JA2003H型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）,722H型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）,DK-8A型电热恒温水浴锅（上海三发科学仪器有限公司）,RE-52c型旋转蒸发器（巩义市予华仪器有限公司）.

1.2 试验方法

1.2.1 鬼针草总黄酮的提取

标准曲线的绘制：精密称取芦丁标准品5.0mg,置100mL容量瓶中,加适量乙醇,使充分溶解,用体积分数为50%的乙醇稀释至刻度,摇匀,即得标准品溶液.分别吸取标准品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,于10mL容量瓶中,加水至5mL,精密加入质量分数为5%的亚硝酸钠试液0.3mL,摇匀.室温放置6min后加入质量分数为10%的硝酸铝试液0.3mL,摇匀.6min后再加入质量分数为4%的氢氧化钠溶液2.0mL,加水至刻度.15min后在510 nm（试验测得的最大吸收波长）处测定吸光度,用空白试剂作参比.以标准品含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线.标准曲线方程为Y=17.049X-0.003 9,R2=0.999 3,线性范围：0~0.025mg/L.

鬼针草总黄酮含量的测定：精密量取样品溶液各0.3mL,其余同“标准曲线的绘制”项中标准品溶液测定方法,计算样品中总黄酮的含量.

正交试验优选鬼针草总黄酮的提取条件：在单因素试验的基础上,确定TFB提取的主要因素和水平（见表1）.精确称取鬼针草粉末9份,每份5 g,分别加入不同体积分数的乙醇溶液100mL,按正交设计表进行提取.提取液过滤后备用.确定最佳提取工艺后分别提取鬼针草叶、枝和全草的总黄酮并检测其含量.

表1 因素水平Tab.1 Factorsand levels

1.2.2 分组及给药 昆明小鼠66只,雌雄各半,随机分为11组：正常对照组（n=6）,模型组（n=6）及鬼针草治疗组（n=54）.其中鬼针草治疗组又分为3个亚组：全草总黄酮治疗组、叶总黄酮治疗组和枝总黄酮治疗组,每亚组又分为高剂量（160mg/kg）、中剂量（80mg/kg）和低剂量（40mg/kg）治疗组,共 9组（n=6）.昆明小鼠分笼饲养,在20~25℃,湿度50%~60%的环境中自由饮食3 d后进行试验.正常对照组每天灌胃相同剂量生理盐水,模型组小鼠每天灌胃相同剂量的乙醇,其余各组分别给予相应的受试药物,每天1次,连续14 d.末次灌胃后2 h,除正常组外,其余各组分别按10mL/kg的剂量腹腔注射用花生油配成的体积分数为0.1%的CCl4溶液.禁食24 h后以体积分数为10%的水合氯醛麻醉,心脏取血分离血清后以IFCC速率法测定ALT、AST和LDH活性.

1.3 检测指标

末次给药后取材,IFCC速率法测定ALT、AST和LDH活性,操作步骤严格按照试剂盒说明书进行.

1.4 统计处理

采用SPSS 11.0统计软件对试验数据进行方差分析（One-Way ANOVA）和t检验,P<0.05表示有显著性差异,P<0.01表示有极显著差异.

2 结果与分析

2.1 鬼针草总黄酮提取条件最佳优化工艺

鬼针草总黄酮提取条件优化结果见表2.

表2 正交试验提取鬼针草总黄酮Tab.2 Contents of TFB by orthogonal test

根据表2中极差（R值）可知,各因素对鬼针草总黄酮的影响顺序为：乙醇体积分数＞提取次数＞提取时间＞提取温度.鬼针草总黄酮的最佳提取工艺为A1B2C2D3,即在固液比为1∶10,乙醇体积分数为80%,提取温度为60℃的条件下提取1 h,提取3次.

2.2 验证试验及鬼针草不同部位TFB含量检测

在最佳条件（A1B2C2D3）下进行提取方法的验证试验,提取得总黄酮46.725mg/g,较正交试验中的最优组43.956mg/g含量高,表明此正交试验得出的最优组合符合实际.称取鬼针草的叶、枝和全草粉末各50 g,在最佳条件（A1B2C2D3）下测定其总黄酮含量,结果见表3.

表3 鬼针草不同部位总黄酮的含量Tab.3 Contentsof TFB in differentphysiologicalparts

由表3可知,鬼针草不同生理部位总黄酮的含量差异较大,其中叶总黄酮含量最大,其次是全草总黄酮的含量,枝的总黄酮含量最低,约为叶总黄酮含量的1/2.

2.3 鬼针草不同部位TFB对急性肝损伤小鼠ALT的影响

鬼针草不同部位TFB对急性肝损伤小鼠ALT的影响结果见图1.

图1 鬼针草不同部位TFB对小鼠ALT的影响Fig.1 EffectofTFB in differentphysiologicalpartson ALT inmice

由图1可知,正常组ALT活性较低,模型组ALT活性极显著高于对照组（P=0.000 0）.鬼针草治疗组与正常组相比,除中剂量枝TFB组ALT活性基本维持在正常水平（P=0.349 6）外,其余各组均有极显著性差异（P＜0.01）.鬼针草治疗组低剂量叶TFB、中剂量枝TFB及低剂量全草TFB,ALT的活性极显著低于模型组（P＜0.01）.其余治疗组ALT活性较模型组均呈极显著的上升趋势（P＜0.01）.

2.4 鬼针草不同部位TFB对急性肝损伤小鼠AST的影响

鬼针草不同部位TFB对急性肝损伤小鼠AST的影响结果见图2.

图2 鬼针草不同部位TFB对小鼠AST的影响Fig.2 Effect of TFB in different physiological partson ALT in mice

由图2可知,模型组中AST活性与正常组相比,有统计学差异（P=0.014 9）.与正常组相比,低剂量叶TFB组中AST活性降低（P=0.019）,低剂量全草TFB组与正常组无统计学差异（P=0.452 6）.其余各治疗组AST活性均高于正常组,并呈极显著性差异（P＜0.01）.与模型组相比,仅低剂量叶TFB组中AST活性较模型组降低,并呈极显著性差异（P=0.002）,其余各治疗组AST活性均呈上升趋势.

2.5 鬼针草不同部位TFB对急性肝损伤小鼠LDH的影响

鬼针草不同部位TFB对急性肝损伤小鼠LDH的影响结果见图3.

由图3可知,与正常组相比,模型组LDH活性升高但无统计学差异（P=0.352 5）,鬼针草治疗叶TFB（低、中和高剂量）组、枝TFB高剂量、全草TFB低和中剂量组中LDH的活性均降低,但统计学分析显示仅有低剂量叶TFB组和低剂量全草TFB组有极显著性差异（P=0.003 2,P=0.000 8）,其余各组均无统计学意义.与模型组相比,LDH活性极显著降低的有低剂量叶和全草TFB组（P=0.000 1,P=0.000 0）、中剂量全草TFB组（P=0.003 4）.

3 讨论

CCl4肝损伤模型是经典的肝损伤模型,CCl4进入肝细胞后,经肝微粒体细胞色素P450代谢为CCl3,引起肝微粒体脂质过氧化,从而破坏肝细胞膜结构和功能的完整性,导致肝损伤[9].ALT、AST和LDH是肝内主要敏感性标志酶[10],当肝细胞受损时三者在血清中的浓度大大增加,因此检测血清中ALT、AST和LDH的活性变化能准确地反应肝细胞的受损程度.

TFB被普遍用于治疗肝脏损伤,但研究发现TFB在急性肝损伤中的作用并不一致.一些研究发现TFB对急性肝损伤具有一定的保护作用[6,11-12],但另一些研究结果却显示鬼针草不同生理部位TFB含量差异较大,并且不同部位TFB的体外抗氧化能力也有较大的差异[7-8].为进一步证明不同生理部位TFB的生理作用,本试验以不同生理部位提取的TFB为材料,初步研究了其在急性肝损伤中的作用.结果显示,鬼针草不同生理部位TFB在不同剂量预适应后对小鼠急性肝损伤的作用不同.鬼针草叶和全草TFB低剂量时能显著降低小鼠血清中ALT和LDH活性,具有明显的急性肝损伤保护作用,而叶和全草TFB高剂量治疗组ALT的活性及枝TFB高剂量治疗组AST的活性显著高于模型组,提示可能有一定的肝损伤作用.本试验结果提示,在选用TFB进行急性肝损伤治疗时,需慎重选择鬼针草不同生理部位TFB的剂量,叶和全草TFB低剂量治疗时的安全性较好.

研究发现TFB可抑制诸如NF-κB、IL-8、TNF-α及NO等炎性相关因子的表达及提高SOD和T-AOC活性,抑制脂质过氧化[2,6],进而显著降低小鼠血清中ALT、AST和MDA活性,减轻肝脏的病理损伤程度[4-5].与多个研究小组的结果相一致,作者前期研究发现叶和全草TFB低剂量能提高血清中SOD活性,降低MDA和iNOS的表达,进一步提示TFB在鬼针草不同生理部位分布的不均匀性及生理活性的差异,且TFB随剂量的升高表现出较高的细胞毒性.虽然本研究初步探明了不同生理部位TFB的活性,但有哪些黄酮在肝损伤中起到了积极作用,有待于我们进一步研究.

综上所述,本试验初步揭示了鬼针草TFB在治疗急性肝损伤中的潜在应用价值及活性部位,研究结果显示低剂量的叶和全草TFB具有较强的急性肝损伤保护作用,为今后鬼针草TFB活性成分追踪及阐明其在急性肝损伤治疗中的作用机制提供了理论依据.

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