抑制小鼠乳腺肿瘤转移microRNA的筛选

张 丽，李小颖，孙彩显，张 旭，陈 炜，张连峰

（中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021）

抑制小鼠乳腺肿瘤转移microRNA的筛选

张 丽，李小颖，孙彩显，张 旭，陈 炜，张连峰

（中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021）

目的 鉴定25种microRNA的功能及其在乳腺癌中发挥的作用，以筛选新的抑制乳腺癌转移的microRNA分子。方法 利用脂质体2000将25种鼠源microRNA表达载体转染至4TO7细胞，经G418筛选结合流式细胞仪分选获绿色荧光细胞得稳定表达鼠源microRNA的细胞株。将细胞2×105个/只尾静脉注射接种于BALB/C小鼠，14 d后解剖分离肺组织，统计小鼠肺组织结节数目。结果 和接种阴性对照细胞小鼠相比，接种mir-449a稳转细胞的小鼠肿瘤肺转移减少。而接种 mir-1935稳转细胞的小鼠肿瘤肺转移增多。其它23种microRNA稳转细胞接种小鼠肿瘤肺转移既不增加也不减少。结论 从25种鼠源microRNA中筛选到2种与乳腺癌肿瘤转移相关的microRNA：mir-449a抑制乳腺癌细胞肺转移，mir-1935则促进癌细胞肺转移。

4TO7；乳腺癌；小RNA；转移；尾静脉注射

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据美国癌症协会统计数据，美国每年有23万乳腺癌新发病例，2012年死亡人数为4万。我国属女性乳腺癌的低发国，但近年来乳腺癌的发病率明显增高，跃居女性恶性肿瘤中的第一位，明显高于其它癌症的发病率。并以每年2％～3％的增长速率递增，严重危害女性的生命和健康。

乳腺癌患者50％经手术治疗后可治愈，50％患者在治疗后5年内出现复发转移，其中30％左右发生转移导致死亡，乳腺癌转移是导致患者死亡的主因。乳腺癌转移好发的部位依次是肺、骨和脑等。转移的恶性肿瘤往往对于传统的肿瘤疗法具有耐受性，且在临床上不可治愈，因此迫切需要深入研究参与肿瘤转移的内在的分子机制。

microRNA（miRNA）是一类长约19-23nt的单链非编码RNA，miRNA与其靶mRNA的3’-UTRs（3’非编码区）特异性结合，引起靶mRNA的翻译抑制或切割降解。miRNA直接作用于约30％的人类基因，而且几乎参与所有的生物过程，包括细胞生长、细胞周期调控、细胞凋亡、分化以及应激反应等。在过去的五年里，一系列参与调节肿瘤转移尤其是乳腺癌转移调节的miRNA被发现，如miR-10b［1］，miR-335［2］，miR-373和 miR-520［3］。此外，miR-200和let-7家族也参与肿瘤的转移调节［4-6］。研究发现，在乳腺癌细胞发展具备转移特性时，一系列的miRNAs的表达丢失，如 miR-335，miR-206，miR-126［2］，miR-31［7］，miR-340［8］等，而恢复其表达则抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，反之则会促进转移。

迄今为止，尽管多种miRNA的癌基因功能以及抑制肿瘤作用已经被阐明，但是肿瘤转移相关的基因和miRNA之间错综复杂的相互作用关系还没有真正清楚，而且目前miRNA靶点治疗还没有获得成功［9］。因此，通过诱导miRNA分子在肿瘤细胞中的表达，可以寻找新的抗肿瘤细胞生长和迁移的miRNA分子靶点，发现更多与乳腺癌肿瘤转移相关miRNA，从而为乳腺癌的治疗提供新的思路。

我室购买了500种miRNA前体表达质粒库，因此可以进行大规模的乳腺癌肿瘤转移相关miRNA筛选。目前，我们已经通过向小鼠乳腺癌4TO7细胞转染miRNA表达载体的方法，获得50种稳定表达miRNA的乳腺肿瘤细胞克隆，并比较了其中25种miRNA过表达对尾静脉移植瘤生长的抑制或促进作用，初步筛选得到一种肿瘤转移抑制miRNA和一种肿瘤转移促进miRNA，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 鼠源m iRNA表达载体构建及质粒制备

鼠源 miRNA表达载体库购自傲锐东源（OriGene Technologies），25条miRNA前体名称及功能见表1（序列参见miRBase）携带SgfI和 MluI酶切位点，被克隆到pCMV-MIR载体的CMV启动子下游。miRNA前体序列长度约600 bp，包含60-70 nt的pre-miRNA且携带上下游250-300 nt的侧翼序列。经测序并比对正确无突变碱基后，质粒小提，醋酸钠无水乙醇沉淀，质粒终浓度达1μg/μL以上，用于细胞转染实验。

1.2 细胞培养

小鼠乳腺癌细胞4TO7由实验室冻存，用含10％胎牛血清（PAA）、100 IU/mL青霉素，100μg/mL链霉素的 DMEM（GIBCO公司）培养基作为4TO7细胞的培养液，于5％CO2，37℃细胞培养箱内常规培养。

采用脂质体2000（Invitrogen公司）转染4TO7细胞（具体转染步骤参照脂质体2000操作说明）。转染后24 h，1∶10传代，用含 500μg/mL G418 （AMRESCO公司）的培养液筛选细胞2周，倒置显微镜（Nikon TS100）下挑选绿色荧光克隆进行扩大培养，流式细胞仪分选绿色荧光标记稳定表达MicroRNAs细胞，并扩大培养。

1.3 实验动物

BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司SCXK（京）2007-0001，雌性，体重18～20 g，在本实验室无特定病原体（specific-pathogen free，SPF）的饲养间（SYXK（京）2009-0003）饲养。所有实验操作程序均经过实验动物研究所实验动物使用管理委员会批准（批准号为ILAS-GC-2012-001）。

1.4 尾静脉注射接种BALB/c小鼠

取对数生长期的转染空载体的4TO7细胞及稳定表达miRNA的4TO7细胞，分别调整细胞浓度至2×106cells/mL。每只 BALB/c小鼠尾静脉接种0.1 mL单细胞悬液。小鼠模型分两组，每组3～6只。阴性对照组，转染pCMV-MIR空载体；阳性组，转染miRNA表达载体。

1.5 观察尾静脉移植瘤生长情况

接种14 d后牺牲动物，解剖分离肺组织，观察肿瘤的生长及转移情况，计数并进行统计学分析。

2 结果

2.1 25种m iRNA表达载体的构建

25条鼠源miRNA前体（表1）携带SgfI和MluI酶切位点，被克隆到pCMV-MIR载体的CMV启动子下游（图1），在转染过程中，细胞内将以CMV启动子驱动miRNA前体表达为成熟miRNA，发挥其相应的细胞学功能性。这些miRNA前体根据其功能及与肿瘤的关系密切程度可以分为三类：已经被实验验证与癌症关系密切的7种miRNA分子如mir-133a-1、mir-148a、mir-24-2、mir-375、mir-376、mir-421、mir-449a；与癌症关系未知的12种miRNA分子如mir-1-2-as、mir-466d、mir-467e、mir-487b、mir-546、mir-568、mir-654、mir-668、mir-682、mir-692-2、mir-763、mir-764等；还有最近新发现的6种miRNA分子包括mir-1193、mir-1895、mir-1902、mir-1931、mir-1935、mir-1940等。

2.2 25种m iRNA的稳定转染细胞系的建立

经过转染，G418筛选结合流式细胞仪分选获得表达25种miRNA的混合细胞克隆，经过多次传代荧光强度稳定，miRNA稳转细胞的形态、生长方式、生长速度等与转染对照质粒的细胞无明显差异。将细胞扩大培养用于BALB/c小鼠尾静脉注射。其对照细胞及三类 miRNA的稳转细胞系（彩插5图2）。

图1 miRNA表达载体的构建

表1 25种鼠源microRNAs及涉及肿瘤Tab.1 25 mousemicroRNAs and related cancer

2.3 m iRNA过表达对乳腺癌细胞系尾静脉移植瘤生长的调节

2.3.1 23种miRNA过表达对乳腺癌细胞肺转移无明显的抑制或者促进作用

将对数生长期的稳定表达miRNA的4TO7细胞和稳定表达对照载体的4TO7细胞分别对BALB/c小鼠进行尾静脉接种。14 d后，脱颈处死，解剖取材，统计肺部肿瘤结节数目。结果发现，和对照组相比，阳性组的小鼠肺组织结节数目没有明显的增加或者减少，因此这些miRNA过表达对肿瘤细胞的肺转移无明显的抑制或者促进作用（图3）。

图3 23种miRNA对乳腺癌肺转移无明显的抑制或者促进作用Note：A-X were 4To7（n=6）、mir-1193（n=3）、mir1-2-as（n=5）、mir-133a-1（n=3）、mir-148a（n=6）、mir-1895（n=4）、mir-1902 （n=3）、mir-1931（n=6）、mir-1940（n=6）、mir-24-2（n=6）、mir-375（n=6）、mir-376a（n=6）、mir-421（n=5）、mir-466d（n=5）、mir-467e（n=6）、mir-487b（n=6）、mir-546（n=6）、mir-568（n= 3）、mir-654（n=6）、mir-668（n=3）、mir-682（n=6）、mir-692-2（n =6）、mir-763（n=3）and mir-764（n=6）.Fig.3 Twenty-threemicroRNAs neither inhibited nor promoted lungmetastases of breast cancer

2.3.2 mir-449a抑制尾静脉移植瘤生长

将对数生长期的转染阴性对照载体的4TO7细胞和稳定表达mir-449a的4TO7细胞分别对BALB/c小鼠进行尾静脉接种。14 d后，脱颈处死，解剖取材，统计肺部肿瘤结节数目。结果发现，和对照组相比，阳性组即接种表达mir-449a的乳腺肿瘤细胞的小鼠肺组织结节数目显著减少，转移程度降低（图4）。

图4 mir-449a过表达抑制肿瘤转移Note：A，Tail vein xenografted tumors of control cells and cells expressing mir-449a； B，The number of metastasis foci in the lungs from mice inoculated with mir-449a-expressing 4To7 cells via tail vein was significantly decreased compared with mice inoculated with negative control cells.Fig.4 mir-449a over-expression inhibited tumor cellmetastasis

2.3.3 miR1935促进尾静脉移植瘤生长

将对数生长期的稳定表达miR-1935的4TO7细胞和稳定表达阴性对照载体的4TO7细胞分别对BALB/c小鼠进行尾静脉接种。14 d后，脱颈处死，解剖取材，统计肺部肿瘤结节数目。结果发现，和对照组相比，阳性组即接种表达mir-1935的乳腺肿瘤细胞的小鼠肺组织结节数目显著增多，转移程度增加（图5）。

3 讨论

肿瘤转移是恶性肿瘤最重要的生物学特性之一，肿瘤转移机制及抗肿瘤的实验研究不可能完全利用人体活检和尸检材料去完成，必须建立相应的动物及人类肿瘤动物转移模型，特别是小鼠模型，这对研究肿瘤的转移机制是极其重要的工具和手段。肿瘤转移动物模型按转移途径可分为血道肿瘤转移动物模型和淋巴道肿瘤转移动物模型。按转移程度还可分为高转移肿瘤转移动物模型（转移率超过70％）和低转移肿瘤转移动物模型（转移率低于30％）。李小颖等［21］对三株荧光素酶标记的小鼠乳腺癌细胞在小鼠体内生长及转移进行比较，研究发现来源于BALB/cfC3H小鼠自发乳腺癌细胞株的4TO7细胞转移能力中等，尾静脉注射14 d，在肺部可见较多肿瘤结节或者转移灶，同时不会因肿瘤结节过多导致动物死亡，可作为研究肿瘤转移的理想细胞模型。因此，本研究选择转移能力中等的4TO7细胞通过脂质体转染诱导多种鼠源miRNA表达，考察不同的miRNA的表达是否对4TO7细胞转移特性改变发生影响。

图5 mir-1935过表达促进肿瘤转移Note：A，Tail vein xenografted tumors of control cells and cells expressingmir-1935；B，The number ofmetastasis foci in the lungs from mice inoculated with mir-1935-expressing 4To7 cells via tail vein was significantly increased compared with mice inoculated with negative control cells.Fig.5 mir-1935 over-expression accelerated tumor cellmetastasis

目前，已经有超过1000种人类miRNA被发现。miRNAs参与多种生物学功能，如调节细胞发育、分化、增殖、凋亡等。一些miRNAs在癌症发生发展中发挥作用，其中一些miRNA抑制肿瘤发生，称为tumor suppressor miRNA（TSmiRs）；另一些 miRNA促进肿瘤发生，则称作 oncogenic miRNAs，即oncomiRs。Tavazoie SF等［2］发现miR-335、miR-126和miR-206具有肿瘤转移抑制能力，其中miR-126能够影响细胞的运动和增殖。miR-335则通过抑制转录因子SOX4的表达抑制乳腺癌转移。由此可见，在肿瘤转移过程中的miRNA是重要和多能的，而且 miRNA复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。因此TSmiRs分子具有十分重要的临床使用价值，发现更多与乳腺癌肿瘤转移相关miRNA，将为乳腺癌的治疗提供更多新的靶点。

mir-449a在多种固体肿瘤和肿瘤细胞系中低水平表达，包括前列腺癌，胃癌，脾癌和肺癌［16-20］。Noonan等［16］报道miR-449a在前列腺癌中低表达，从而导致了前列腺癌细胞中组蛋白脱乙酰基酶-1 （histone deacetylases，HDAC-1）过表达，而HDAC-1是一种原癌基因。这暗示了mir-449a可能是一种抑癌基因，其表达异常可能与癌症发生有关。罗等［20］报道mir-449a在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）组织和细胞系中表达下调，和淋巴结转移和低生存率相关，在体外实验中可以通过c-Met靶点抑制肿瘤迁移和侵袭。迄今为止，还没有mir-449a与乳腺肿瘤转移相关的报道。本研究中，mir-449a过表达的4TO7细胞，和对照细胞相比，尾静脉注射产生肺部转移的能力下降，提示mir-449a对乳腺癌肿瘤转移具有抑制作用。与之功能相反的是mir-1935，在本报道中表现出促进肿瘤转移的作用，目前国际上还没有类似的报道，也缺少对其功能的预测，因此有关其肿瘤转移的调节机制还需深入的研究。

综上所述，本研究首次通过尾静脉移植瘤小鼠模型对鼠源miRNA过表达对乳腺肿瘤转移的影响作用进行较大规模筛选，并已经获得初步进展。从25种鼠源miRNA中筛选到2种与乳腺癌肿瘤转移相关的miRNA：mir-449a抑制尾静脉移植瘤生长，mir1935促进尾静脉移植瘤生长。其余23种鼠源miRNA对小鼠乳腺癌细胞的转移无明显的促进或者抑制作用。未来我们将继续展开工作，以期获得更多参与乳腺癌转移过程的miRNA。miRNA疗法将有可能成为治疗乳腺癌的有效方式，关于miRNA新功能的研究，将为乳腺癌的治疗开启一扇新的大门，为乳腺癌患者带来希望。

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The study of screening breast tumor suppressor m icroRNA in m ice

ZHANG Li，LIXiao-ying，SUN Cai-xian，ZHANG Xu，Chen Wei，ZHANG Lian-feng
（Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College（PUMC），Beijing 100021，China）

Objective To investigate the functional role of 25 microRNAs in breast cancer，and to find new tumor suppressor microRNAs that may serve as specific targets of new gene therapies. M ethods Twenty-five microRNAs expression vectors were constructed and stably transfected into mouse mammary tumor cells 4To7 by Lipofectamine2000.Cells were selected with G418 and sorted by Flow cytometry.The cells in logarithmic phase were collected and 2×105cells/mouse was inoculated into BALB/cmice via tail vein.Lungswere harvested 14 days after tumor cell inoculation，and the number ofmetastasis fociwas counted.Results Mice inoculated with mir-449a-expressing 4To7 cells via tail vein developed reduced lungmetastases compared with mice inoculated with negative control cells.Mice inoculated with mir-1935-expressing 4To7 cells via tail vein developed increased lung metastases compared with mice inoculated with negative control cells.Other twenty-threemicroRNAs neither promoted nor inhibited lungmetastases of breast cancer.Conclusions Two of twenty-fivemicroRNA were identified to be associated with breast cancermetastasis.MiR-449amay play a tumour suppressor role in the regulation of migration and metastasis in breast cancer.miR-1935 transgenic over-expression promoted tumor growth and metastasis.

4TO7；Breast cancer；Micro RNA；Metastasis；Tail intravenous injection

张连峰，E-mail：Zhanglf@cnilas.org。

R332

A

1671-7856（2014）03-0072-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.015

国家“重大新药创制”科技重大专项课题“啮齿类研发平台创新药物研究开发技术平台建设”（2011ZX09307-302）；国家科技支撑计划课题“神经和代谢疾病基因工程模型的建立”（2012BAI39B02）。

张丽，女，博士，E-mail：zhangliqq2004@126.com。

2014-02-17

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