整体柱固相萃取-高效液相色谱法在线分析水果中的氯吡脲

罗伟强， 肖小华， 杜 卓， 李攻科

(1.中山大学化学与化学工程学院，广东广州510275;2.广西民族大学化学化工学院，广西南宁530006)

氯吡脲(forchlorfenuron，CPPU)又名调吡脲，化学名称为1-(2-氯-4-吡啶基)-3-苯基脲，是一种广泛应用于农业生产的新型高效植物生长调节剂。由于长期接触CPPU会引起体内蛋白质代谢的紊乱、肺气肿和体形消瘦，欧盟、日本、美国等已对其残留量进行严格限制，不同作物中CPPU最大残留限量(MRL)为 10 ～100 μg/kg［1，2］。我国规定西瓜和黄瓜中CPPU的MRL为0.1 mg/kg，而猕猴桃和葡萄中为0.05 mg/kg。目前，国内外对CPPU残留分析的研究主要包括溶剂萃取［3］、固相萃取［4－7］等有效的样品前处理方法，以及灵敏的气(液)相色谱-质谱联用［8］、液相色谱［9］、放射免疫方法［10］等分析方法。由于蔬果中CPPU残留含量通常很低，样品基质和待测组分具有不确定性等因素的影响，其分析检测要求具有精细的操作手段、较高的灵敏度和较强的特异性。现有的离线样品处理与色谱分析等方法存在样品易受污染、损失以及分析灵敏度不高等缺点，难以满足复杂基体中痕量CPPU残留的分析要求。

有机聚合物整体柱具有单体多元化且易得、易制备、易被修饰、通透性和耐溶剂性能好等优点，在整体柱的制备及应用中备受青睐，已成功地应用在食品、环境、催化、生物等众多领域中［11，12］;另外，整体柱也可作为色谱分离柱使用，实现复杂基体中痕量分析物的快速检测和快速分离［13］。不锈钢基质的硬度高、尺寸均一，可以避免玻璃毛细管整体柱易折断的现象，适合作为整体柱管材［14］。目前不锈钢管整体柱前处理技术在蔬果样品CPPU在线分析中的应用还未见报道。

本文制备了不锈钢管基材的固相萃取整体柱，结合HPLC/UV建立了整体柱固相萃取-HPLC在线联用方法。考察了萃取溶剂的pH值及其流速、溶剂解吸时间及其流速等因素对CPPU萃取率的影响，并用于水果中CPPU的在线分析检测。

1 实验部分

1.1 仪器、材料和试剂

1.1.1 仪器

LC-10Avp高效液相色谱仪(Shimadzu，日本)，Cary100紫外光谱仪(Varian，美国)，红外光谱仪Thermo Scientific Nicolet 330，Hitachi 4300冷场电子扫描显微镜(SEM)(Hitachi，日本)，Diamonsil(TM)钻石 C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，Dikma)，离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)，超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，冰箱(－20℃，青岛海尔公司)，分析天平(0.1 mg，梅特勒-托利多公司)，涡旋机(上海精科仪器有限公司)。

1.1.2 材料

黑葡萄、猕猴桃和西瓜等样品购于中山大学农贸市场。样品新鲜，表面无虫害，冷藏保鲜。对易腐坏的样品需冷冻保存，测定时避免反复解冻。

1.1.3 试剂

甲基丙烯酸(MAA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、聚乙二醇-6000(PEG-6000)均购自天津大茂化学试剂厂;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)购自广州千湖贸易有限公司。甲醇、乙腈、乙酸均为色谱纯;二氯甲烷为分析纯。氯吡脲标准品(纯度98.0%)购于北京百灵威公司。水为纯净水(深圳怡宝食品饮料有限公司)。

CPPU标准溶液(200.0 mg/L):称取20.0 mg氯吡脲标准品，用甲醇定容到100 mL容量瓶中，置于－20℃冰箱中保存。

1.2 不锈钢管固相萃取整体柱的制备与表征

1.2.1 不锈钢管的预处理

内径1.2 mm的不锈钢管先用1 mol/L NaOH溶液浸泡1 h，再用1 mol/L的HCl溶液浸泡1 h，然后用超纯水清洗并于120℃干燥1 h，待用。

1.2.2 甲基丙烯酸-二甲基丙烯酸乙二醇酯(MAA-co-EGDMA)整体柱(50 mm ×1.2 mm)的制备

参照文献［15］方法，将功能单体 MAA 47 μL、交联剂 EGDMA 400 μL、PEG-6000 160 mg、致孔剂甲醇1 100 μL和引发剂AIBN 4.5 mg混合均匀并超声10 min得到预聚液;将预聚液注入已处理的不锈钢管中，用硅橡胶封堵两端并在60℃下反应24 h。待反应完成后，将整体柱中的致孔剂及未反应的试剂用甲醇冲洗除去。将整体柱截成50 mm左右长度保存待用。

1.2.3 MAA-co-EGDMA 整体柱的表征

采用冷场电子扫描显微镜观察不锈钢管整体柱截面结构及形貌特征;通过萃取量计算表征其萃取性能，通过流速与压力关系表征其通透性。其中，萃取量N的计算公式为:

式(1)中，N为目标物的萃取量，A为目标物在整体柱-HPLC在线分析时的色谱峰面积，a1及b1分别为氯吡脲采用直接进样分析时进样量(ng)与峰面积线性方程的斜率及截距。

1.3 样品分析

准确称取切碎的水果样品2.0 g置于50 mL具塞离心管中，加入10 mL乙腈涡旋振荡萃取4 min，再超声波辅助萃取10 min;重复萃取1次，合并2次萃取液于离心管中，以4 000 r/min离心10 min。将上层清液置于125 mL分液漏斗中，加入10 mL水和4.8 mL二氯甲烷，强烈振荡，收集上层有机相并浓缩至干，残留物用20.00 mL甲醇-水溶液(1∶99，v/v)复溶，过0.45 μm滤膜，制得样品溶液。将样品溶液引入整体柱后，以甲醇-水(1∶99，v/v)为溶剂，以0.8 mL/min速率进行萃取;然后用0.4 mL乙腈-0.2%乙酸水溶液(50∶50，v/v)为溶剂解吸，解吸液在线转入HPLC中进行分析。HPLC条件:色谱柱为 Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相为乙腈-0.2%乙酸水溶液(50∶50，v/v)，流速为1.0 mL/min，检测波长为261 nm。

水果中CPPU的回收率R按以下公式计算:

式(2)及(3)中，N和A分别为整体柱固相萃取-HPLC分析时CPPU的萃取量(ng)和色谱峰面积，a2及b2为整体柱固相萃取-HPLC分析方法线性方程的斜率及截距，CS及VS为实际样品中CPPU的加标浓度(μg/L)及体积(mL)。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取整体柱的性能

2.1.1 固相萃取整体柱的形态表征

参照文献［15］方法制备得到的 MAA-co-EGDMA整体柱通过SEM表征其形貌特征，如图1所示。其中图1a为放大60倍时整体柱的截面图，图1b为放大2 000倍时整体柱的内部形貌图。从图1可见固相萃取整体柱具有比较疏松的结构，结构较均匀，既有小颗粒与“簇”之间形成的中孔，也有小颗粒之间形成的微孔，保证了整体柱有良好的通透性。

图1 不锈钢管固相萃取整体柱的扫描电镜图Fig.1 SEM images of stainless steel solid-phase extraction monolithic column

此外，聚合物颗粒的红外光谱结果显示，在3 437 cm－1出现了单体甲基丙烯酸中的－OH特征伸缩振动峰，在2 951 cm－1处出现了－C－H的伸缩振动峰，在1 730 cm－1处出现了羰基的伸缩振动峰(这是甲基丙烯酸中的羧基以及二甲基丙烯酸乙二醇酯中酯的羰基峰)，在1 630 cm－1处出现双键的伸缩振动峰。这些红外谱图中的特征峰与制备过程中添加试剂的红外谱图相吻合。

2.1.2 固相萃取整体柱的通透性

以水为流动相，采用流速实验测试制备的整体柱的通透性，得到其流速-压力曲线。结果表明，整体柱的压力(Y)与流动相流速(X)之间具有良好的线性关系，其线性方程为Y=0.342 1X+0.362 9，相关系数 R2=0.997 5。在流动相流速超过 2.5 mL/min时，整体柱的柱压不超过1.3 MPa。当柱压为0.7 MPa时，该整体柱的流速可以达到1.0 mL/min，说明该不锈钢管整体柱具有很好的通透性。

2.2 整体柱固相萃取-HPLC在线分析装置

采用2个六通阀和整体柱构建了整体柱固相萃取-HPLC在线联用系统，其中六通阀Valve 1主要实现样品引入功能，Valve 2主要实现在线萃取、解吸和分析进样功能，通过两阀切换实现在线萃取解吸和分析检测(见图2)。在实际样品分析中，先将样品引入Valve 1的定量环中，然后通过泵1推动萃取溶剂将样品引入Valve 2中的整体柱进行萃取和净化;然后通过泵2将流动相引入整体柱进行解吸进样，完成样品溶液在线萃取、解吸和分析过程。

图2 整体柱固相萃取-HPLC在线联用装置示意图Fig.2 Schematic representation of on-line device based on monolithic column solid-phase extraction coupled with HPLC

2.3 固相萃取整体柱的萃取条件的优化

固-液两相之间的萃取和解吸是待测目标物在固-液相间分配、传质、平衡循环的一系列过程，因此萃取和解吸条件对在线萃取过程影响很大。本文分别考察了萃取溶剂的pH值及其流速、解吸溶剂的体积及其流速等主要因素对CPPU萃取量的影响。

2.3.1 萃取溶剂的pH值及其流速

根据氯吡脲的极性及文献［4］的结果，本文以9 mL甲醇-水(1∶99，v/v)作为整体柱的萃取溶剂，考察了溶剂的pH值及其流速等因素对氯吡脲萃取效率的影响。考察以不同pH的甲醇-水(1∶99，v/v)为萃取溶剂时CPPU在固相萃取整体柱上的萃取量，结果如图3a所示。随着萃取溶剂pH的增加，CPPU的萃取量没有发生明显的变化，表明溶液pH值对CPPU萃取量的影响较小。考虑到萃取溶剂的经济成本以及环保等因素，最后选用了pH 6.0～7.0(即不调节pH，直接用)的甲醇-水(1∶99，v/v)作为萃取溶剂。

萃取溶剂的流速与系统承受的压力有关，并直接影响CPPU的萃取效率。考察了不同萃取溶剂流速(0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL/min)对 CPPU 萃取量的影响，结果见图3b所示。在萃取溶剂流速为0.5 mL/min时CPPU的萃取量最大;流速为0.7 mL/min时CPPU的萃取量较流速为0.5 mL/min时减少了4.6%;相比流速为0.5 mL/min，流速为0.8 mL/min时萃取量只减少8.0%。这可能是由于不锈钢管整体柱的通透性较好，样品溶液以渗透的形式接触到整体柱的吸附位点，从而使溶剂流速对CPPU的吸附量影响较小。为了加快分析速度，减少整体柱长时间承受较大压力，选取0.8 mL/min为萃取溶剂流速。

2.3.2 解吸溶剂的体积及其流速

解吸溶剂的体积及其流速对整体柱的萃取性能及其与HPLC在线分析的溶剂和时间匹配性关系密切。解吸溶剂的体积过大、流速太高或太低都容易导致HPLC的谱峰展宽。本文考察了以流动相(乙腈-0.2%乙酸水溶液(50∶50，v/v))作为解吸溶剂，其体积和流速对CPPU解吸效果的影响，结果见图3c、3d。随着解吸溶剂的体积从0.4 mL增加到1.2 mL，CPPU 的萃取量略有增加，但0.4 mL的解吸溶剂基本可使整体柱内吸附的CPPU解吸完全。而随着解吸流速由0.2 mL/min增大到0.3 mL/min，CPPU的萃取量明显增大;再继续增大流速观察，发现解吸溶剂的流速影响较小。为了缩短分析时间和减小HPLC中的峰展宽现象，选择0.4 mL/min作为最优的解吸溶剂流速。

图3 整体柱固相萃取条件的优化Fig.3 Optimization of extraction conditionsa.pH of extraction solution;b.flow rate of extraction solvent;c.volume of desorption solvent;d.flow rate of desorption solvent.

综上所述，CPPU萃取和解吸的优化条件为:萃取溶剂为9.0 mL甲醇-水(1∶99，v/v)溶液;萃取流速为0.8 mL/min;解吸溶剂为乙腈-0.2%乙酸水溶液(50∶50，v/v);体积为 0.4 mL，流速为 0.4 mL/min。

2.3.3 固相萃取整体柱吸附容量的考察

吸附容量是评价整体柱性能的重要指标。在最优的整体柱萃取和解吸条件下，用200 μg/L的氯吡脲标准溶液，通过改变标准溶液体积考察固相萃取整体柱的吸附容量，结果见图4。实验结果表明，当萃取体积达21 mL后，整体柱的吸附容量基本保持不变，此时整体柱的吸附容量为1 163 ng。

2.4 整体柱固相萃取-HPLC在线联用方法

2.4.1 分析方法的建立

配制不同浓度的CPPU标准溶液，在优化的萃取、净化和分析条件下，采用整体柱固相萃取-HPLC在线联用方法对其分析定量。在0.01～50.00 μg/L之间，以CPPU的峰面积(Y)对其质量浓度(X，μg/L)进行线性回归，得到的线性方程为Y=5.24×104X+61，相关系数r=0.999 9，表明线性关系良好。以信噪比为3确定方法的检出限为25 ng/L。采用1.0 μg/L标准样品考察方法的精密度(n=5)，其RSD为3.9%，满足痕量分析要求。

实验中CPPU的富集因子为采用整体柱萃取富集后经HPLC分析得到的CPPU浓度和20 μL直接进样的CPPU浓度的比值，结果表明在优化条件下，CPPU的富集倍数可达214倍。

图4 200 μg/L氯吡脲在整体柱上的吸附容量实验曲线Fig.4 Adsorption capacity of 200 μg/L CPPU at flow rate of 0.8 mL/min

2.4.2 实际样品分析

采用建立的方法测定了市售黑葡萄、猕猴桃和西瓜等3种水果样品，未检出CPPU(见图5)。分别对这些水果样品进行加标回收率测定，结果见表1。可见CPPU的回收率为87.0%～120.7%，RSD为0.6%～9.2%，表明基体对测定结果基本不产生干扰，方法的准确度较高，适合水果等复杂基体中痕量CPPU残留分析检测。

表1 水果样品中氯吡脲的加标回收率(n=3)Table 1 R ecoveries of CPPU spiked in differentfruits(n=3)

2.4.3 方法对比

表2给出了文献报道的采用固相萃取-HPLC测定水果中CPPU的结果对比。结果表明，与现有方法相比，本文新建方法的灵敏度较高，更适合复杂体系中痕量氯吡脲残留的分析检测。

图5 整体柱固相萃取-HPLC在线联用分析实际样品的色谱图Fig.5 Chromatograms of real fruit samples by monolith column SPE-HPLC in online modea.original sample;b.spiked sample with 0.6 μg/L CPPU.

表2 本文方法与文献报道的固相萃取-HPLC方法测定水果中氯吡脲的对比Table 2 Comparison of the proposed method with other methods from the references for the determination of CPPU in fruits

3 结论

本实验采用原位聚合法研制了高通透性MAA-co-EGDMA不锈钢管整体柱，整体柱的吸附容量达1 163 ng，富集倍数为214倍。建立了整体柱固相萃取在线富集-HPLC联用方法并在线分析了黑葡萄、猕猴桃和西瓜等水果中CPPU的残留量。方法的线性范围为0.01～50.00 μg/L，检出限为25 ng/L，RSD 3.9%。黑葡萄、猕猴桃和西瓜中氯吡脲的加标回收率为87.0%～120.7%，RSD为0.6%～9.2%，满足水果样品中痕量氯吡脲分析的要求。

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