基于整体材料搅拌棒固相萃取高效液相色谱联用测定饲料和水样中硝基呋喃类药物残留

张 咏， 梅 萌， 黄晓佳， 袁东星

(厦门大学环境与生态学院滨海湿地生态系统教育部重点实验室，福建厦门361005)

呋喃唑酮(FZD)、呋喃妥因(NFT)和呋喃西林(NFZ)属于硝基呋喃类(NFA)抗生素，由于具有优良的药效和较长的持药性而被广泛用于饲料添加剂、治疗药物或直接投入水体防治病害［1，2］。近几年来发现NFA及其代谢物具有强的“三致”毒副作用，欧盟、日本、中国等国家与组织都将其列为禁用药物。但有研究表明，有不法分子仍在动物饲料及饮用水中非法添加NFA，2002－2003年欧盟在其从葡萄牙、希腊等国进口的猪肉中检测出NFA及其代谢物［3］。因此监测饲料和水样中的硝基呋喃类抗生素可以从源头上监控 NFA的非法使用［4，5］。目前高效液相色谱法是分析NFA的最常用方法［6，7］，但实际样品基底的复杂性要求样品分析前必须进行合适的前处理。固相萃取(SPE)是分析NFA最常用的样品前处理方法，但其操作繁琐，同时需要较多的有机溶剂［8，9］。因此发展简便、高富集效率和环境友好的样品制备技术对NFA的监测具有重要意义。搅拌棒固相萃取技术(SBSE)是一种集萃取、富集、净化为一体的新型样品前处理技术，具有操作简便、溶剂使用量少、富集倍数高和环境友好等优点［10，11］。但目前SBSE主要的商品化涂层——聚二甲基硅氧烷(PDMS)只能有效富集中性和弱极性化合物，而NFA均为强极性物质(FZD、NFT和NFZ的logKow值分别为－0.04、－0.47和0.23)，因此可以预计PDMS-SBSE无法直接萃取NFA。

我们在前期研究中制备了以聚(乙烯基咪唑-二乙烯基苯)(VIDB)整体材料为涂层的SBSE，由于极性基团咪唑基的存在，VIDB-SBSE可通过包括氢键、偶极-偶极及疏水等多重作用力对极性化合物进行有效萃取［12，13］。因此在本研究中，利用 VIDBSBSE来萃取3种极性NFA，同时与高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)联用，建立可对饲料和水样中NFA残留进行有效监测的VIDB-SBSEHPLC-DAD分离分析体系。本研究还对比了其他自制的基于整体材料的SBSE(SBSEMs)对上述3种NFA的萃取性能，并计算了目标物在这些SBSEMs上的分配系数。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱设备:LC-20AB泵;CBA-20A控制器;SPD-M20A DAD检测器(Shimadzu，Kyoto，Japan);进样阀:7725i(Rheodyne，USA);定量阀:20 μL。商品化搅拌棒(PDMS-SBSE):涂层材料为PDMS，棒长 20 mm，涂层厚度 1.0 mm(Twister;Gerstel，Müllheim a/d Ruhr;Germany)。自制的基于整体材料的SBSE包括VIDB-SBSE(以聚(N-乙烯基咪唑-二乙烯基苯)整体材料为涂层［12］)、VPDBSBSE(以聚(N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯)整体材料为涂层［14］)、VPDE-SBSE(以聚(N-乙烯基吡啶-乙二醇二甲基丙烯酸酯)整体材料为涂层［15］)和VPDP-SBSE(以聚(N-乙烯基邻苯亚胺-N，N-二甲基双丙烯酰胺)整体材料为涂层［16］)。这4种SBSE的棒长均为30 mm，涂层厚度均为1.0 mm。

FZD、NFT和NFZ标准品均购自Sigma公司;乙腈(ACN)和甲醇(色谱纯)购自Tedia公司(Fairfield，USA);全部实验用水均为超纯水(Millipore，Bedford，MA，USA)。

1.2 标准溶液的配制

分别称取2.5 mg各标准样品，以甲醇溶解并定容于25 mL棕色瓶中，配制成100 mg/L的单标准储备液，置于4℃的冰箱中保存。使用时，用甲醇为稀释液，取各单标准储备液适量，用稀释液配制成所需浓度的混合标准溶液。

饲料样品购自厦门市场;实际水样采自厦门淡水养殖场，置于冰箱冷藏待用。

1.3 色谱条件

色谱分离柱:Kromasil LC-18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:水/乙腈(体积比为 75∶25)二元溶液;流速:1.0 mL/min;检测波长:366 nm;进样体积:20 μL。

1.4 实际样品前处理

饲料样品:准确称取1.0 g样品于离心管中，加入2.5 mL乙腈，漩涡振荡混匀5 min，然后超声提取5 min，高速离心10 min，取上清液。用2.5 mL乙腈再重复提取一次，合并两次提取液。取1.0 mL提取液于250 mL烧杯中，加入99 mL水，将溶液pH 值调到10.0，并加入15%(质量分数)的 NaCl。放入搅拌棒以300 r/min的速度进行搅拌萃取2.0 h。萃取完成后，取出搅拌棒，将其放置于3.0 mL乙腈中，在同样的搅拌速度下解吸1.5 h，解吸液直接进行色谱分析。

实际水样:将水样过0.45 μm滤膜，然后取100 mL滤液于250 mL烧杯中，余下步骤(调pH，加入NaCl，萃取，解吸)同饲料样品的处理。

1.5 目标物在整体材料涂层和水中分配系数(KMC/W)的计算

根据文献［17］，FZD、NFT 和 NFZ 的 KMC/W计算如方程(1)所示。

其中，KMC/W为萃取达平衡时，目标物在整体材料涂层中的浓度(CMC)和水中的浓度(CW)之比，即等于目标物在整体材料涂层中的质量(mMC)和水中的质量(mW)之比与相比的乘积。在本研究中，所使用的以整体材料为涂层的4根搅拌棒相比均为1 062。

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的优化

在SBSE过程中，萃取和解吸时间、样品基底pH值和离子强度对目标物的富集性能有较大影响。为了得到VIDB-SBSE对3种NFA的最佳萃取条件，本研究对上述萃取条件进行了详细优化。

2.1.1 萃取和解吸时间的优化

图1为萃取时间对萃取效率的影响。由图1可见，在其他实验条件保持不变时，萃取时间在0.5～2.0 h之间时，随着萃取时间的增加，VIDB-SBSE对3种目标物的萃取量逐渐增大，在2.0 h时，吸附达到平衡。因此，实验中选择2.0 h为最佳萃取时间。解吸时间对实验结果也有较大影响。本研究考察了解吸时间在15～120 min之间时解吸效果的变化，实验结果表明在90 min的时候，目标化合物可以从VIDB-SBSE中被完全解吸，因此解吸时间确定为1.5 h。

图1 萃取时间对萃取效率的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction efficiencyConditions:desorption time was 1.0 h;the pH value of sample matrix was unadjusted;no salt was added;the spiked concentration of each analyte was 50 μg/L.

2.1.2 pH 值的影响

由于硝基呋喃类药物分子结构中含有丰富的氮原子，同时整体材料结构中存在着咪唑基团，因此样品基底pH值会影响NFA和咪唑基团的存在形式，从而影响VIDB-SBSE对NFA的萃取性能。在其他实验参数不变的条件下，基底pH值从2.0增加到12.0，其对萃取效率的影响如图2所示。从图2中可以看出，当pH值较低时，VIDB-SBSE主要通过疏水作用对NFA进行吸附，但此时NFA和整体材料的咪唑基团中的氮原子均被质子化而产生电荷排斥作用，因而减弱了VIDB-SBSE对目标物的吸附能力。随着pH值的升高，质子化程度减弱，电荷排斥作用减小，因此萃取性能提高。随着pH值的继续增加，氮原子完全去质子化，此时除了疏水作用外，咪唑基团和NFA还存在着氢键和偶极-偶极作用，在多重作用力下，VIDB-SBSE对NFA的萃取能力进一步增强。但当pH提高到10以上时，溶液中过多的OH－严重削弱了氢键和偶极-偶极作用，导致萃取性能下降。根据实验结果，选择10.0为最优pH值。

图2 样品pH值对萃取效率的影响Fig.2 Effect of pH value of sample matrix on extraction efficiencyConditions:extraction and desorption times were 2.0 h and 1.5 h，respectively;no salt was added;the spiked concentration of each analyte was 50 μg/L，and the sample pH values were adjusted by 0.1 mol/L HCl or 0.1 mol/L NaOH.The symbols are the same as in Fig.1.

2.1.3 离子强度的影响

根据文献［14－17］，对于极性化合物的萃取，由于存在盐析作用及静电相互作用，因此离子强度对萃取效率有很大影响。本实验通过添加不同量的NaCl来改变基底的离子强度，添加量从0到35%(质量分数)(0、5%、10%、15%、20%、25%、30% 和35%)。从图3可以看出，当NaCl含量为15%时，VIDB-SBSE对目标物的萃取性能均达到最大值，因此选择15%为最佳的NaCl添加量。

综合实验结果，VIDB-SBSE对3种NFA的最佳萃取条件为:吸附2.0 h，解吸1.5 h，基底pH值调为10.0，NaCl的含量为15%。

2.2 与其他SBSE的对比

在最佳萃取条件下，VIDB-SBSE对FZD、NFT和NFZ显示出理想的萃取性能。从图4可以看出，与加标水样富集前(图4a)相比，经过VIDB-SBSE富集后，3种目标物的色谱峰明显增高(图4c)，VIDB-SBSE对FZD、NFT和NFZ的富集效率分别为76.5%、82.2%和80.1%，而商品化的 PDMSSBSE则对目标物没有富集效果(图4b)。

图3 离子强度对萃取效率的影响Fig.3 Effect of ionic strength in sample matrix on extraction efficiencyConditions:pH value was adjusted to 10.0.The other conditions were the same as in Fig.2.

图43 种硝基呋喃类药物经VIDB-SBSE和PDMS-SBSE萃取后的色谱图Fig.4 Chromatograms of FZD，NFT and NFZ after enrichmentwithVIDB-SBSEandPDMSSBSEa.direct injection of spiked water sample with each analyte at 50 μg/L;b.spiked water sample with each analyte at 50 μg/L and treated with PDMS-SBSE;c.spiked water sample with each analyte at 50 μg/L and treated with VIDB-SBSE.

图5 不同SBSEMs富集3种硝基呋喃类药物后的色谱图Fig.5 Chromatograms of FZD，NFT and NFZ after enrichment with different SBSEMs

图5为自制的不同SBSEMs对 FZD、NFT和NFZ萃取性能比较，从图5中可见，不同SBSEMs对FZD、NFT和NFZ有不同的萃取性能。VIDB-SBSE对FZD和NFZ的萃取性能优于其他3种SBSEMs，而VPDB-SBSE则对NFT有最高吸附能力，这说明不同涂层的SBSE对不同化合物具有不同的萃取性能。表1列出了呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃西林在不同SBSEMs上的分配系数，分配系数越大，说明该SBSEM对目标物的吸附能力越强。表1数据表明，3种目标物在4种SBSEMs的K值均高于KPDMS/W，说明这4种自制的SBSEMs对3种目标物的吸附能力均优于商品化的PDMS-SBSE，其原因主要是这几种SBSEMs涂层中含有极性基团和疏水基团，因此可通过多重作用力对NFA进行有效萃取，而PDMS-SBSE则只能通过较弱的疏水作用萃取目标物，因此萃取性能较低。

2.3 标准工作曲线的制作

用标准储备液配制不同浓度梯度的溶液，在最佳萃取条件下，考察方法的线性范围、相关系数、检出限、定量限及日内和日间重复性，结果见表2。

表1 呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃西林在不同SBSEMs上的分配系数Table 1 Distribution coefficients(K)of FZD，NFT and NFZ on different SBSEMs

表2 3种NFA的线性范围、线性相关系数(R2)、检出限、定量限、萃取效率及日内和日间重复性Table 2 Linear ranges，correlation coefficients(R2)，LODs and LOQs，extraction efficiencies，inter-day and intra-day precisions achieved for the three NFA

从表2中的数据可知，呋喃唑酮的线性范围为0.5～200 μg/L，呋喃妥因和呋喃西林的线性范围为0.25～200 μg/L，3种目标化合物均具有良好的线性关系(R2＞0.99)。同时研究取得了与 MS检测［18，19］在同一级别的灵敏度，其 LOD 在 0.068 ～0.11 μg/L 之间，LOQ 在 0.22 ～0.36 μg/L 之间，所建方法的日内和日间的实验重复性良好(RSD＜6%)。表明本方法具有较高的灵敏度和重复性。

2.4 实际样品测定及加标回收率试验

将所建的VIDB-SBSE-HPLC-DAD方法用于饲料和实际水样中NFA的测定，其结果如表3所示。结果表明，在一个水样中测得低浓度的NFT，而饲料样品均未检出NFA。实际样品中复杂基底可能对萃取效率产生影响，为了考察所建立的方法用于实际样品中3种NFA物质测定的可行性，测定了饲料和实际水样中不同加标量的回收率。从表3可以看出，对于两种不同质量浓度加标量(5.0和100 μg/L)，在不同饲料和水样中均取得了理想的回收率，3种目标物的回收率在80.6%～108%之间。同时实验重现性良好，所有RSD值均小于10%。

表3 实际饲料和水样中3种目标物的测定结果及加标回收率(n=3)Table 3 R esults of determination and recoveries of water and feed samples spiked with the three target analytes(n=3)

3 结论

本研究利用自制的以聚(N-乙烯基咪唑-二乙烯基苯)整体材料为涂层的SBSE萃取饲料和水样中的3种硝基呋喃类化合物，由于萃取介质可与目标物产生多种作用力，因此VIDB-SBSE可对3种目标物进行直接有效萃取。在此基础上，建立了可对实际饲料和水样中硝基呋喃类药物进行有效监测的VIDB-SBSE-HPLC-DAD分离分析方法。研究结果表明，所建方法具有萃取效率高、操作简便、检出限低、重现性好、环境友好等特点。

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