一种混合模式反相弱阳离子交换色谱填料的制备及其保留机理

彭西甜， 冯钰锜

(1.生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学系，湖北武汉430072;2.湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，湖北武汉430064)

随着生命科学和药物化学的发展，针对极性带电化合物的分离分析越来越重要，传统的反相液相色谱(RPLC)在分离这类化合物时存在保留弱、峰形和选择性差等问题，因此，亟待开发新的色谱分离方法来提高对极性带电化合物的分离能力。近年来，结合反相疏水和离子交换保留机理的反相离子交换混合模式色谱(MMC)因可以对极性带电分析物提供很好的保留和分离选择性而得到了较快的发展［1－3］。反相弱阳离子交换(RP/WCX)色谱一般将羧基作为固定相表面的离子交换官能团，随着流动相pH值的变化，羧基官能团的电荷状态随之变化，从而影响带电分析物的保留行为，使分析物通过离子交换的保留行为更容易得到调节;同时，结合疏水的保留机理，可以提供更好的分离选择性［4］。一些商品化和新发展的混合模式RP/WCX固定相在多肽［5］、离子液体［6］、多种碱性化合物［4，7－9］等的分离中都取得了很好的效果。尽管混合模式色谱的应用价值已经得到了色谱工作者的普遍认可，然而目前对其保留机理进行定量的研究仍相对较少［10－12］。

炔基和叠氮的“点击化学(click chemistry)”反应具有反应条件温和、选择性好以及产率高等特点，色谱工作者采用该方法制备了各种性质的色谱固定相，并取得了很好的分离效果［13－15］。在本文中，我们首先制备了辛基-叠氮官能化的混合配体硅胶材料，然后通过叠氮和丙炔酸之间的“点击化学”反应将羧基引入到硅胶表面，得到了一种混合配体辛基-羧基共同键合硅胶(OCS)的RP/WCX固定相材料;进而以3种同系物阳离子表面活性剂作为探针分子，定量研究了该固定相材料混合分离模式的保留机理，该研究可对MMC的实际分离应用提供有价值的参考;最后，将该固定相用于一系列标准化合物的分离，取得了很好的分离效果。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

安捷伦1200型液相色谱系统(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)，配有 G1311A 四元泵、G1315B DAD紫外检测器、G1329A自动进样器、G1330B柱温箱和G1322A脱气机;AVTAR-360红外分析仪(Thermo Nicolet，Madison，USA);EL III Universal CHNOS Elemental Analyzer元素分析仪(Elementar，Germany)。

球形硅胶(5 μm粒径，10 nm孔径及300 m2/g比表面积)购自 Welch Materials，Inc(Maryland，US)。3-氯丙基三乙氧基硅烷(CPS)和正辛基三乙氧基硅烷(OTS)购自湖北武大有机硅新材料股份有限公司。苄基十四烷基二甲基溴化铵(BTAB)、苄基十二烷基二甲基溴化铵(BDAB)、苄基十六烷基二甲基溴化铵(BHAB)、叠氮化钠(NaN3)和丙炔酸购自阿拉丁试剂(上海，中国)。西酞普兰(citalopram)、氟伏沙明(fluvoxamine)、多虑平(doxepin)、丙咪嗪(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)和氯丙咪嗪(clomipramine)以及克伦特罗(clenpenterol)、特步他林(terbutaline)、心得安(propranolol)均购自中国药品生物制品检定所。毒品标准品3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(3，4-methylenedioxymethamphetamine)、3，4-亚甲二氧基苯丙胺(3，4-methylenedioxyamphetamine)和氯胺酮(ketamine)由北京市公安局提供。黄连素(berberine)购自百灵威。苯甲酸、联苯、醋酸铵(NH4Ac)、异丙醇、碘化钠、甲醇(MeOH)、丙酮、甲苯、三乙胺(NEt3)和乙腈(ACN)购自上海国药试剂厂。实验所用的蒸馏水采用成都艾柯纯水仪制备。

1.2 OCS固定相填料的制备

本文中用于混合模式RP/WCX的固定相材料的合成方法采用了叠氮和炔基的“点击化学”反应将羧基引入到硅胶表面，具体的合成步骤见图1。

首先按3种不同反应物比例制备了辛基叠氮基共同键合硅胶ONS。具体合成方法如下:将2.50 g活化硅胶分散在20 mL甲苯中，按照表1所示的投料比加入各个反应物，110℃回流反应20 h后，过滤，分别用甲苯、甲醇和丙酮洗涤3次，60℃真空干燥，备用。

其次，采用叠氮和炔基的“点击化学”反应方法将羧基键合到上述辛基叠氮共同键合硅胶ONS上。即将ONS-1、ONS-2和ONS-3分别分散在30 mL水和30 mL甲醇的混合溶剂中，加入一定量的丙炔酸(ONS-1、ONS-2、ONS-3 分别加入 0.50 g、0.20 g、0.12 g)，75℃回流反应72 h，过滤，分别用甲醇、水和丙酮洗涤3次，得到辛基羧基共同键合硅胶(OCS-1、OCS-2和OCS-3)，60℃真空干燥，备用。

图1 混合模式OCS填料的制备过程Fig.1 Schematic procedure for the preparation of mixed-mode OCS packing

表1 制备3种ONS键合硅胶材料所用试剂的反应比Table 1 R eaction material ratios for the preparation of the three ONS packings

1.3 色谱柱的填装和HPLC条件

采用密度匀浆技术，以异丙醇为匀浆剂，MeOH为淋洗剂，在41.4 MPa的压力下，分别将OCS-1、OCS-2和OCS-3硅胶装入150 mm×4.6 mm不锈钢色谱柱柱管中。以不同比例的ACN/NH4Ac溶液的混合物作为流动相，流速1 mL/min，进样体积20 μL，检测波长254 nm 或230 nm。以 NH4Ac溶液的pH值作为流动相pH值。流动相使用前采用G4砂芯漏斗过滤，超声5 min脱气。柱温设为40℃，至少重复两次进样。

2 结果和讨论

2.1 固定相的表征

采用傅里叶转换红外光谱(FT-IR)和元素分析(EA)法表征了所合成的ONS和OCS材料。以ONS-2和OCS-2的FT-IR图为代表，在波数为2 866 cm－1和2 930 cm－1处的谱峰是C-H伸缩振动吸收峰;在ONS-2谱图上有明显的叠氮伸缩振动吸收峰(2 110 cm－1)，而OCS-2谱图上叠氮吸收峰消失(见图2)，证明了叠氮和炔基之间发生了“点击化学”反应。3种固定相的元素分析结果表明:固定相上含有碳和氮元素，从OCS-1到OCS-3碳含量逐渐增加，而氮含量逐渐降低(见表2)，符合我们初步的设想。

表2 3种OCS填料的元素分析结果Table 2 Elemental analysis results of the three OCS packings

图2 ONS-2和OCS-2吸附剂的傅里叶转换-红外光谱图Fig.2 FT-IRspectra of ONS-2 and OCS-2

2.2 保留机理的考察

在前期的工作中，我们制备了混合模式反相/强阳离子交换(RP/SCX)和反相/弱阴离子交换(RP/WAX)的固定相填料，并采用混合模式的单点和两点保留机理数学模型定量研究了分析物在混合模式固定相上的保留机理，结果表明两点保留机理更加符合实验的结果［11，12］。混合模式保留机理的单点模型认为在固定相的一个位点上同时发生反相和离子交换的保留过程，溶质的保留是两种相互作用的吉布斯自由能加和;而两点模型认为固定相表面存在两种独立的保留位点:一部分带电分析物同固定相的疏水官能团发生疏水相互作用，一部分带电分析物同固定相表面的离子官能团发生离子相互作用，因此溶质的保留是疏水保留和离子交换保留的加和。在单点模型中，保留因子同盐浓度的倒数和对数的关系可以用下面两个数学方程来表示［10］:

而在两点模型中，这两个关系可以表达为［10］:

已知在纯离子交换过程中存在以下关系［10］:

其中，kT、kRP和kIEX分别为总的保留因子、反相的保留因子和离子交换的保留因子，CIEX为离子交换的平衡常数，［E+］m为流动相中反离子的浓度。

从方程(1)和(3)可知，不管是单点还是两点保留机理，保留因子与流动相中盐浓度的倒数是线性相关的，区别在于:在单点保留模型中斜率同离子交换的平衡常数、固定相表面的电荷数量以及反相的保留因子密切相关，截距为零;而在两点保留模型中，斜率同离子交换的平衡常数以及固定相表面的电荷数量密切相关，截距为反相的保留因子。从方程(2)和(4)可以看出，在单点模型中分析物保留因子的对数对盐浓度的对数作图可以得到一条斜率约为－1的直线，而在两点模型中，只有当分析物的保留是以离子交换的保留为主时(kRP＜＜kIEX)，两者对数关系的斜率才约等于－1。

此外，在纯的RPLC中，对于同系物的探针分子，分析物反相保留因子kRP的对数和亚甲基数目nCH2存在如下线性关系［16］:

其中，KRP和φRP分别为纯的RPLC平衡常数和分配比;A为logkRP对nCH2作图所得直线的截距;而斜率B与一个亚甲基官能团在从流动相转移到固定相时引起的自由能的变化有关。一般来说，对于同一个RPLC固定相，不同的同系物它们的斜率B应该是相同的［14］。因此，对于单点保留机理，将方程(7)代入单点保留机理的方程(2)，以保留因子的对数对nCH2作图时，得到方程(8)。

其中A'为A与logCIEX之和。

从两点保留机理方程(4)可知，假如疏水作用占主导作用(kRP≫kIEX)，且离子交换作用与溶质的疏水性无关，当以保留因子的对数对nCH2作图时，对所有的同系物，应该可以得到斜率相同的直线;假如离子交换作用与溶质的疏水性相关，或者离子交换作用对分析物的保留影响很大，那么这个公式不能作为判断单点或两点保留机理是否正确的依据。

本文采用3种同系物阳离子表面活性剂(结构式如图3所示)作为探针分子，结合混合模式的单点和两点保留机理的数学模型，定量研究了它们在混合模式RP/WCX的OCS固定相上的保留机理，得出了单一RP或WCX作用力对总保留的影响，对混合模式色谱的实际分离应用具有一定的理论参考价值。

图3 3种同系物阳离子表面活性剂的分子结构Fig.3 Structures of three homologues of cationic surfactant

2.2.1 保留因子对数和盐浓度对数的关系

考察了保留因子对数和盐浓度对数的线性关系。结果显示，所有分析物在3根色谱柱上分离时，保留因子对数和盐浓度对数的线性关系均良好，但是斜率不等于－1，因此，不符合单点保留的机理(单点保留机理认为所得直线的斜率为－1);而对于两点保留机理，如果离子交换的保留占主导地位，那么该直线的斜率约等于－1。从OCS-1到OCS-3，随着固定相疏水性的增加，所得直线的斜率与－1的偏差也越来越大，表明疏水作用对溶质保留影响较大(见表3)。

2.2.2 保留因子和盐浓度倒数的关系

将分析物保留因子对盐浓度倒数进行线性拟合，所有分析物均获得很好的线性关系，同时得到了一个正的截距(见表4)。按照单点保留机理，直线的截距为零;而两点保留机理认为直线的截距等于反相的保留因子，因此正的截距表明该混合模式符合两点保留机理。另外，从表4结果可知，同一根色谱柱，从BDAB到BHAB，随着亚甲基数目的增加，直线的截距依次增大，说明疏水保留因子依次增加。直线的斜率同离子交换的平衡常数有关，从BDAB到BHAB，随着溶质疏水性增加，斜率也依次增加，该结果体现了“疏水辅助”的离子交换保留机理。而同一个分析物在不同色谱柱上的疏水保留相比较，从OCS-1到OCS-3，固定相疏水性逐渐增加，分析物的疏水保留也依次增加。

表3 盐浓度对阳离子表面活性剂在3种OCS固定相上保留的影响*Table 3 Effect of ammonium concentration on the retention of cationic surfactants on the three OCS columns*

表4 3种同系物在OCS柱上的保留因子和流动相盐浓度倒数的关系Table 4 Dependence of the retention factors of the three homologues on the reciprocal of ammonium concentration on the OCS columns

2.2.3 离子交换作用对总的保留的影响

根据两点保留机理的数学模型，保留因子对盐浓度倒数的线性拟合方程的截距是反相保留因子，由此，我们可以得出离子交换的保留在总的保留中所占的比例。表5结果显示，随着盐浓度的增加，离子交换的保留因子降低，而疏水的保留基本不受影响，因此，离子交换在总的保留中的比例降低。而3根OCS柱相比较，由于羧基键合量的逐渐减小，其离子交换的保留从OCS-1到OCS-3依次减小。

从表5我们可以得到纯的离子交换的保留因子，进而验证离子交换保留方程(6)。表6显示了离子交换保留因子的对数对盐浓度的对数作图的线性关系，在3根OCS色谱柱上线性关系都很好，且斜率基本都为－1，很符合纯的离子交换的保留关系，进一步证明了两点保留机理能更加准确地描述分子与固定相之间的相互作用。

表5 分析物在3种OCS柱上的保留因子对流动相盐浓度倒数作图的斜率和截距分析Table 5 Analysis of slopes and intercepts(kR P)of the plots of kR Pvs 1/［NH+4］for the analytes on the OCS columns

表6 分析物离子交换保留因子的对数与流动相盐浓度对数的线性关系分析Table 6 Analysis of logkIEXvs log［NH+4］for the analytes

2.2.4 保留因子对数和分析物亚甲基数目的关系

进一步考察了阳离子表面活性剂(BDAB、BTAB和BHAB)和烷基苯(苯、甲苯、乙苯和丙苯)两类同系物的保留因子对数与亚甲基数目之间的关系。结果表明:盐浓度对烷基苯的保留基本没有影响;两类同系物在3根色谱柱上的线性关系都很好(见表7)。由单点模型的方程(8)可知，两类同系物的线性斜率应该是相同的，然而在同一根色谱柱上，阳离子表面活性剂和烷基苯两类同系物的线性斜率并不相同，烷基苯的斜率明显大于阳离子表面活性剂，该结果进一步表明了单点保留机理不适合描述分析物在混合模式固定相上的保留过程。而对于两点保留模型，由于离子交换作用对分析物的保留影响较大，且分析物和固定相之间可能存在“疏水辅助”的离子交换位点，这个线性关系不适用于区分哪种保留机理更合适。

表7 两类同系物(阳离子表面活性剂和烷基苯)的保留因子与亚甲基数目及铵离子浓度的关系考察Table 7 Study of retention factors of two types of homologues(cationic surfactants and alkylbenzenes)as function of nCH2and ammonium concentration

3 应用

采用混合模式RP/WCX的OCS-3固定相填料分离了3种阳离子表面活性剂、6种抗抑郁药及7种碱性溶质分子的标准混合物，取得了很好的分离效果(见图4)，表明该固定相具有一定的应用前景。

图4 (a)3种阳离子表面活性剂、(b)6种抗抑郁药及(c)7种碱性溶质分子在混合模式R P/WCX的OCS-3柱上的色谱图Fig.4 Chromatograms of(a)three cationic surfactants，(b)six antidepressants and(c)seven basic solutes on the mixed-mode R P/WCX OCS-3 columnMobile phases:a.ACN/50 mmol/L NH4Ac(70∶30，v/v)at pH 5.0;b.ACN/50 mmol/L NH4Ac(40∶60，v/v)at pH 5.0;c.ACN/20 mmol/L NH4Ac(50∶50，v/v)at pH 6.0.Peaks:1.BDAB;2.BTAB;3.BHAB;4.citalopram;5.fluvoxamine;6.doxepin;7.imipramine;8.amitriptyline;9.clomipramine;10.terbutaline;11.3，4-methylenedioxyamphetamine;12.ketamine;13.3，4-methylenedioxymethamphetamine;14.clenpenterol;15.propranolol;16.berberine.

4 结论

本文采用叠氮和炔基的“点击化学”反应方法制备了一种混合配体的辛基羧基共同键合硅胶的固定相材料。采用阳离子表面活性剂同系物详细考察了该混合模式RP/WCX固定相的单点和两点保留机理，证明了两点保留机理更加符合实验的结果。通过两点保留机理的数学模型，得到了疏水或离子交换的单一作用力对总保留的影响，对实际样品的分离应用具有参考价值。最后将该混合模式的RP/WCX固定相应用于碱性分子、阳离子表面活性剂及抗抑郁药的分离，取得了很好的效果。

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