低温条件下小鼠树突状细胞功能改变及玉屏风散的调节作用

张巧凤，郭钰琪，李 霞，王 丽，张洪海，姚成芳

(1山东省医学科学院基础医学研究所，济南250062;2济南大学、山东省医学科学院医学与生命科学学院)

机体的免疫功能受外界环境因素的影响，温度变化也可影响免疫功能［1，2］。低温可致人体免疫功能下降，对慢性支气管炎、哮喘等疾病易感或加重［3］。机体的皮肤及黏膜系统作为与外界相通的屏障，对环境温度变化极敏感。树突状细胞(DC)是机体黏膜系统的重要组成部分，是连接固有免疫及适应性免疫的桥梁，在组织局部捕获抗原后，通过循环系统迁移，并依赖其表面分子递呈抗原、启动T细胞活化及极化，发挥重要的免疫调节作用。目前关于低温对DC的影响尚不明了。中药玉屏风散为防邪入侵的经典方剂，具有抗菌、抗病毒、免疫调节及增强免疫功能等作用［4］，临床广泛用于治疗外感疾病。为探讨低温及玉屏风散处理对DC功能的影响，2012年10月～2013年9月，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 ①实验动物:清洁级雌性BALB/c小鼠50只，6～8 周龄，体质量(17.92 ±1.03)g，购自北京维通利华实验动物公司。②药物、试剂及仪器:玉屏风散由防风、黄芪、白术组成。FITC-CD86、PE-I-Ad(MHC-Ⅱ，BD Pharmingen 公司)，PE-Cy5-CD11C(eBioscience公司)，CFS-CCR7(R ＆ D 公司)，dNTP、RNA酶抑制剂、Taq酶(上海生工生物公司)，内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、CD86、CCR7引物由上海铂尚生物公司合成。流式细胞仪(美国BECKMAN)，紫外分光光度计、凝胶成像系统(美国)，PCR扩增仪(德国Biometra)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 将50只小鼠随机均分为对照组(室温25℃)、模型组(室温10℃)及玉屏风散小、中、大剂量组。玉屏风散小、中、大剂量组分别为225、450、900 mg/(kg·d)，连用 7 d;对照组及模型组自由饮水。给药第4天时，将模型组及玉屏风散各组置于低温［(10±1)℃］容器内，连续处理3 d，每天6 h。

1.2.2 DC表面分子表达检测 各组小鼠眼球取血约1 mL，置于抗凝管中，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，PBS洗两遍，收集细胞。用PBS将收集的外周血单个核细胞重悬至100 μL，每管加入新鲜大鼠血清 20 μL，室温、避光孵育30 min。按流式抗体说明书依次加入以下抗体，即PEI-Ad、PE-Cy5-CD11C、FITC-CD86或 PE-I-Ad、PE-Cy5-CD11C、CFS-CCR7，4 ℃避光染色 30 min，用 PBS 清洗两遍，用流式细胞术检测DC表面分子MHC-Ⅱ、CCR7、CD86表达。

1.2.3 CCR7、CD86mRNA表达检测 外周血单个核细胞总RNA提取:将分离的外周血单个核细胞先后用TRIzon试剂裂解、氯仿抽提、异丙醇沉淀、75%乙醇及无水乙醇洗涤，经紫外分光光度仪检测RNA的纯度与含量。RT反应:采用Oligo dT为RT反应引物，取1.5 μg总RNA逆转录合成cDNA 40 μL。PCR反应:总反应体系为25 μL，包含RT 产物4.5 μL、10 ×PCR buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、上下游引物各0.25 μL、10 mmol/L dNTP 0.5 μL、Taq DNA 聚合酶 1 μL，DEPC水14 μL。反应条件为95℃预变性5 min，94℃ 1 min，58～60℃ 1 min，72℃ 1 min，26个循环后，70℃补延伸10 min。用1.5%凝胶电泳后，采用Alpha凝胶成像系统分析目的基因的表达水平，以GAPDH为内参照，计算目的基因片段CD86、CCR7与同步GAPDH的灰度值比，作为其mRNA相对表达量。

1.2.4 统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件，数据以±s表示，计量资料两组间比较用独立样本t检验，多组间比较用One Way-ANOVA方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组体质量及肛温比较 连续低温处理3 d后，对照组体质量及肛温分别为(17.68±1.57)g、(35.96 ±1.61)℃，模型组分别为(18.66 ±0.90)g、(33.40 ±1.26)℃，玉屏风散小剂量组分别为(17.16 ±0.95)g、(34.30 ±1.49)℃，玉屏风散中剂量组分别为(17.14 ±0.82)g、(34.16 ±2.31)℃，玉屏风散大剂量组分别为(18.00 ±1.63)g、(34.32 ±1.08)℃。各组体质量比较均无统计学差异;与对照组比较，其余4组肛温降低(P均＜0.05)。

2.2 各组 MHC-Ⅱ、CCR7、CD86蛋白表达比较 见表1。

表1 各组 MHC-Ⅱ、CCR7、CD86蛋白表达比较(n=10，%，±s)

表1 各组 MHC-Ⅱ、CCR7、CD86蛋白表达比较(n=10，%，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05;与玉屏风散其他剂量组比较，▲P ＜0.05

35.93 ±2.99 16.87 ±0.59 28.65 ±4.22模型组 26.25 ±3.85* 12.40 ±1.16＊＊ 16.31 ±0.67＊＊玉屏风散小剂量组 32.15 ±5.04▲ 12.13 ±1.93 21.77 ±1.43△玉屏风散中剂量组 42.84 ±4.47△ 21.84 ±3.99△▲ 25.76 ±4.05△玉屏风散大剂量组 44.04 ±4.67△ 14.04 ±3.46 28.47 ±2.61对照组△

2.3 各组CCR7、CD86mRNA相对表达量比较 对照组CCR7、CD86mRNA相对表达量分别为0.44±0.13、0.38 ±0.08，模型组分别为 0.32 ±0.03、0.21±0.04，玉屏风散小剂量组分别为 0.31 ± 0.05、0.41±0.05，玉屏风散中剂量组分别为 0.50 ±0.12、0.25 ±0.06，玉屏风散大剂量组分别为0.61 ±0.08、0.36 ±0.06。模型组与对照组，模型组与玉屏风散中、大剂量组比较，CCR7、CD86mRNA相对表达量下降(P均 ＜0.05)。

3 讨论

机体体表皮肤温度较其他部位略低，易受外界环境温度的影响［5］。作为皮肤和黏膜系统的重要固有免疫细胞，DC在局部组织中发挥重要的免疫屏障作用，在稳态条件下DC介导机体维持耐受，机体受病原体侵袭时引起免疫反应［6，7］。

DC分为非成熟阶段及成熟阶段，稳态条件下，体内多数DC处于未成熟状态，具有较强的吞噬、摄取抗原能力;未成熟DC通过其表面的模式识别受体(如Toll样受体)接触抗原或受炎症因子影响后，开始从局部组织向外周淋巴器官迁移［8］。在迁移过程中DC逐渐成熟，其可上调共刺激分子CD80、CD86表达，以及高表达 MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子等，将加工、处理后的抗原以抗原肽-MHC-Ⅱ类分子复合物的形式递呈给初始T细胞使之激活，从而启动适应性的免疫应答［9］。在迁移过程中，DC主要通过淋巴管或血循环进入次级淋巴器官，外周血是各组织DC捕获抗原后发生迁移的汇聚地。

以往文献报道，温度降低时机体免疫功能受到抑制，对病原体感染的抵抗力降低［10～12］，但对其免疫机制尚不清楚。本研究显示，低温下循环DC表达CCR7的能力降低，显示DC迁移能力下降;DC表面分子MHC-Ⅱ、CD86表达下调，提示抗原递呈并刺激初始T细胞活化的能力降低。鉴于DC在固有免疫及适应性免疫中发挥重要作用，一直以来其都被认为是免疫治疗的最佳选择［13］。因此，以后研发DC相关疫苗及其用于其他免疫治疗时，均应考虑低温对DC生物学功能的影响。

玉屏风散出自元代朱震亨的《丹溪心法》，由黄芪、防风、白术配伍组成，是益气、固表、防邪入侵的经典方剂，临床多用于治疗变态反应性疾病［14］。该方剂具有抗病毒、抗细菌感染功效［15］，可促进小鼠呼吸道、肠道黏膜分泌 SIgA，增强局部免疫功能［16～17］，促进小鼠腹腔巨噬细胞释放 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8，从而发挥免疫调节作用［18］。本研究显示，与模型组相比，玉屏散各组 DC表面分子MHC-Ⅱ、CCR7、CD86表达水平提高，抗原递呈能力增强。提示玉屏风散可提高上述分子的表达水平，逆转低温引起的DC功能下降，有利于DC在局部黏膜免疫中发挥重要作用。

综上所述，低温条件下DC表面分子表达降低，玉屏风散能增强小鼠的DC功能，调节机体免疫功能，这可能是其发挥益气固表、防邪入侵的药理基础。

［1］吴茜，陈慧玉.高温环境对机体某些免疫指标的影响［J］.西藏医药杂志，2000，21(4):14-14.

［2］Russwurm S，Stonans I，Schwerter K，et al.Direct influence of mild hypothermia on cytokine expression and release in cultures of human peripheral blood mononuclear cells［J］.J Interferon Cytokine Res，2002，22(2):215-221.

［3］陈锡群，龚孝淑，江基尧，等.低温对颅脑损伤大鼠脾淋巴细胞转化功能及自然杀伤细胞活性的影响［J］.中华实验外科杂志，2000，17(5)446-447.

［4］王妍，石学魁.玉屏风散增强小鼠免疫功能的研究［J］.牡丹江医学院学报，2010，31(3):46-47.

［5］Thomas KA，Burr R，Wang SY，et al.Axillary and thoracic skin temperatures poorly comparable to core body temperature circadian rhythm:results from 2 adult populations［J］.Biol Res Nurs，2004，5(3):187-194.

［6］Lanzavecchia A，Sallusto F.Regulation of T cell immunity by dendritic cells［J］.Cell，2001，106(3):263-266.

［7］Steinman RM，Hemmi H.Dendritic cells:translating innate to adaptive immunity［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2006，311:17-58.

［8］Banchereau J，Steinman RM.Dendritic cells and the control of immunity［J］.Nature，1998，392(6673):245-252.

［9］Banchereau J，Briere F，Caux C，et al.Immunobiology of dendritic cells［J］.Annu Rev Immunol，2000，18(1):767-811.

［10］ Sheffield CW，Sessler DI，Hunt TK.Mild hypothermia during isoflurane anesthesia decreases resistance to E.coli dermal infection in guinea pigs［J］.Acta Anaesthesiol Scand，1994，38(3):201-205.

［11］Kurz A，Sessler DI，Lenhardt R.Perioperative normothermia to reduce the incidence of surgical-wound infection and shorten hospitalization［J］.N Engl J Med，1996，334(19):1209-1216.

［12］Salo M.Hypothermia and infection［J］.Acta Anaesthesiol Scand，1994，38(3):199-200.

［13］Fong L，Engleman EG.Dendritic cells in cancer immunotherapy［J］.Annu Rev Immunol，2000，18(1):245-273.

［14］曹继军.玉屏风颗粒的药效学研究［J］.中国临床药理学杂志，2010，26(5):390-394.

［15］唐国顺.玉屏风散防治“非典”机理探讨［J］.中医文献杂志，2003，(3):35-37.

［16］张磊，王岚，吴瑕，等.玉屏风散总多糖不同给药方式和时相影响小鼠免疫功能的对比研究［J］.中药药理与临床，2006，22(2):5-7.

［17］蔡清和，蔡彩玲.匹多莫德加玉屏风防治小儿反复呼吸道感染的疗效观察［J］.中国临床实用医学，2010，4(6):104-106.

［18］田维毅，杨娟，王平，等.四物汤等复方多糖组分对小鼠腹腔巨噬细胞释放细胞因子的影响［J］.中华中医药杂志，2009，24(4):515-517.