即时高压氧治疗对大鼠脑缺血后脑水肿及水通道蛋白4表达的影响

陈方圆，于敏，张立新，张志强

·基础研究·

即时高压氧治疗对大鼠脑缺血后脑水肿及水通道蛋白4表达的影响

陈方圆，于敏，张立新，张志强

目的观察即时高压氧治疗对缺血早期脑水肿形成的影响，并探讨其可能的机制。方法健康成年雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠18只，随机分为假手术组(n=6)、对照组(n=6)和高压氧组(n=6)。对照组及高压氧组采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，其中高压氧组在舱内升压时进行模型制备并予高压氧治疗60 min。各组均于术后6 h行Longa评分法评分，采用干湿比重法检测脑组织含水量，免疫组化SP法观察水通道蛋白4(AQP4)表达，应用图像分析系统进行半定量分析。结果与对照组比较，高压氧组大鼠神经功能评分改善(P＜0.05)，缺血半球脑含水量减少(P＜0.05)，AQP4表达量减少(P＜0.05)。结论即时高压氧治疗可有效缓解脑缺血后症状，对脑水肿的发生有抑制作用；AQP4表达减少可能是其机制之一。

脑缺血；高压氧；神经功能评分；脑水肿；水通道蛋白4；大鼠

[本文著录格式]陈方圆，于敏，张立新，等.即时高压氧治疗对大鼠脑缺血后脑水肿及水通道蛋白4表达的影响[J].中国康复理论与实践,2014,20(9):823-826.

脑是人体最重要的器官，质量仅占体质量的2%～3%，但其需氧量却占全身供给量的20%～25%。脑中几乎无葡萄糖和氧的储备，因此脑组织对缺血缺氧耐受性极差。高压氧目前被认为可能通过提高组织溶解氧含量及增加氧气在组织中的弥散距离，改善组织缺氧状态，从而避免组织因缺血缺氧发生的一系列损伤[1-2]。但同时高压氧的干预时间及次数一直是学术界争论的问题[2-3]。本实验采用升压过程中，在氧舱内制备大鼠脑缺血模型，缺血同时给予高压氧治疗，并以缺血后6 h神经功能学评分、脑组织含水量、水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)表达作为观测指标，观察即时高压氧治疗对局灶性脑缺血损伤的作用，并初步探讨其治疗机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物与仪器

健康成年雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠18只，体质量200～250 g，由中国医科大学实验动物中心提供。标准饲料喂养，使用动物专用洁净垫料，恒温20～25℃。高压氧治疗采用烟台宏远GY3200型氧舱。

1.2 实验方法

1.2.1 分组将18只大鼠按随机数表法随机分为假手术组、对照组和高压氧组，每组6只。假手术组不做造模处理，只相应解剖、分离和缝合；对照组建立局灶性大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型；高压氧组则在高压氧舱升压过程中制备MCAO模型，升压20 min，稳压(2个大气压)70 min，稳压后吸100%纯氧60 min，中间休息两个5 min；降压20 min出舱。将大鼠置于约1 m3的密闭容器中，将氧气管连接其中，并将该容器内温度控制在22～25℃，其中放入少量碳酸钙以吸收大鼠呼出的二氧化碳。

1.2.2 模型制备采用改良Longa线栓法。选用直径0.26 mm市售尼龙鱼线，剪成5 cm长，一端用细砂纸打磨光滑，头端浸入液态硅胶中5 mm，确保提起后有薄层硅胶膜附于鱼线表面，测量总直径为0.27～0.30 mm，待硅胶凉干后使用。大鼠造模前禁食24 h，禁水6 h。称重后3.5%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉。麻醉后动物仰卧固定于手术台上，于颈前正中切开皮肤，游离右侧颈总动脉(CCA)及其颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)，电凝ECA分支并结扎ECA。动脉夹夹闭CCA和ICA，在距CCA分叉3 mm处用4.5号针头扎一小孔，将已栓线插入CCA，向上穿过CCA分叉处进入ICA；松开ICA的动脉夹，继续将尼龙线插入到ICA颅内段，插入深度平均为(18.5± 0.5)mm，外留10 mm。结扎ICA起始段，固定栓线。消毒并逐层缝合皮肤。将动物侧卧置于单独的笼内。假手术组大鼠操作方法相同，只是插入鱼线深度＜10 mm。

1.2.3 模型入选标准以上实验动物均于6 h后断头取脑。取脑前参照Longa评分标准对实验动物进行评分，评分0分或4分者剔除，死亡者剔除，其余视为造模成功，纳入模型组。如模型组数量不足，则随时补充每组所需数量。

1.2.4 观测指标

1.2.4.1 一般行为学观察术后按时观察大鼠的外观、反应、进食、活动等情况并进行记录。

1.2.4.2 神经功能学评分模型成功后6 h，采用Longa评分法进行神经功能评分。0分，无明显神经功能缺损(肢体活动正常)；1分，轻度局灶性神经功能症状缺失(不能完全伸展左侧前肢)；2分，中度局灶性功能缺失(行走时向左侧旋转)；3分，重度神经功能缺失(行走时向左侧倾倒)；4分，极重度损伤(不能自发行走，意识丧失)。

1.2.4.3 脑组织含水量测定各组缺血后6 h，麻醉后快速断头取脑。采用干湿比重法测定脑组织含水量。称取湿重后，于85℃烤箱中烘烤至恒重，称取干重，按Elliott公式计算脑含水量：

1.2.4.4 AQP4的表达神经功能评分完毕后，各组大鼠断头处死，取出完整脑组织，冠状切下嗅球及额极前部约4 mm，取此切面向后约2 mm厚脑组织常规固定[4]，石蜡包埋，切片，片厚5 μm。相邻切片置于经多聚赖氨酸包被的清洁载玻片上，SP法免疫组织化学染色。

切片脱蜡后置于3%H2O2溶液中孵育30 min，0.01 mol/L PBS(pH=7.4)涤洗5 min，共3次；置0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)中，加热至100℃抗原修复3 min，室温冷却30 min；PBS洗5 min，共3次；正常山羊血清封闭液37℃孵育30 min，滴加一抗(兔抗大鼠AQP4多克隆抗体，l∶900稀释)，4℃孵育过夜。PBS洗5 min，共3次；加入生物素化二抗工作液(山羊抗兔IgG)37℃孵育20 min；PBS洗5 min，共3次；加辣根过氧化物酶37℃孵育20 min；DAB显色30 s；苏木素复染后中性树胶封片。每只鼠取1张完整切片，在脑皮质表达区取4个完整而不重叠的视野，高倍镜视野下(400×)拍摄数码照片后输入计算机，采用医学图像分析系统BI-2000测定每个视野下AQP4蛋白平均光密度值，取平均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 神经功能学评分

对照组和高压氧组大鼠在造模6 h后均出现不同程度神经功能缺损体征：行动迟缓、拖步，被提尾悬空时左侧前肢不能伸直，行走时向左侧倾倒、转圈等。高压氧组神经功能学评分低于对照组。见表1。

表1 各组大鼠神经功能学评分

2.2 脑组织含水量

各组缺血对侧脑组织含水量无显著性差异(P＞0.05)。缺血侧对照组和高压氧组均高于假手术组(P＜0.05)，对照组高于高压氧组(P＜0.05)。见表2。

表2 各组脑组织含水量(mg%)

2.3 AQP4表达

图1 对照组及高压氧组AQP4表达

AQP4阳性表达多位于血管周边的星形胶质细胞足突上，胞浆内亦有少量表达，胞核未见表达。阳性细胞为空泡状，且在缺血灶周边的表达轻于缺血核心区。对照组缺血侧可见大量AQP4阳性细胞表达，高压氧组表达低于对照组。见图1、表3。

表3 各组脑组织AQP4表达(平均光密度值)

3 讨论

目前研究认为，高压氧的治疗机理主要是在高压状态下，氧气在组织中的溶解量及弥散距离得以增加，并以生理方式经体液循环供应到全身各处，特别是缺氧组织中，从而纠正缺氧，延缓因缺氧造成的组织伤害，促进组织修复[1-3]。本实验采用缺血同时给予高压氧治疗，目的是最大限度发挥高压氧对缺血组织的保护作用。实验发现，缺血同时给予单次高压氧治疗即可有效改善脑梗死后肢体功能。大鼠脑缺血后6 h的神经功能缺损体征，包括行动迟缓、拖步，被提尾悬空时左侧前肢不能伸直，行走时向左侧倾倒、转圈等，高压氧组均较对照组有一定程度减轻，神经功能评分高压氧组与对照组比较有显著性差异；这与高压氧组脑水肿程度减轻、AQP4表达量下降的结果一致。

AQPs是一种红细胞膜上的膜通道蛋白，目前被认为有极高的水通透性，而对其他小分子不通透。迄今为止，在哺乳动物脑组织中共发现3种水通道蛋白：AQP1、AQP4和AQP9。AQP4为其中最重要的一种，主要分布在侧脑室及导水管的室管膜细胞、脉络丛上皮、下丘脑、视上核、海马齿状回和小脑的Pukinje细胞[5-8]。有研究证实，体外培养敲除AQP4基因的星形胶质细胞，对水分子的通透性降低[9-10]，提示AQP4在脑组织液体转运，脑水肿的发生、发展及消散，脑脊液的生成及重吸收等方面发挥着重要作用。

本研究显示，AQP4在脑缺血中心及周边神经细胞中均有高表达，可能与缺血后应激反应所致脑血管收缩，使缺血中心和周边脑组织中存在不同程度缺血、缺氧有关。实验中还发现，脑缺血后AQP4的表达和脑水肿的变化一致，AQP4表达量高则脑水肿程度重，AQP4表达量低则脑水肿程度轻，相关研究证实了这一结论[8,11-12]。

如果能有效抑制AQP4的表达，将有可能减轻缺血后脑水肿的程度。Papadopoulos等的实验证实，AQP4基因敲除小鼠，损伤后脑水肿的形成明显滞后于未敲除组，而60 h的生存率亦明显提高[9-10]。本研究显示，脑缺血经过高压氧干预，脑组织水肿程度降低。说明在缺血早期，单次高压氧治疗即能有效减轻缺血后组织的水肿程度。有研究指出，早期和每日多次高压氧治疗能更为有效地降低缺血后脑组织的水肿程度，提高存活率。

众多研究表明，高压氧减轻脑水肿存在多种途径和机制，抑制AQP4表达仅是其中一种。有人认为，高压氧可通过抑制低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表达，减轻脑组织的水肿程度[13-15]等。详细机制还需进一步研究证实。

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Effects of Instant Hyperbaric Oxygen Therapy on Brain Edema and Expression of Aquaporin-4 after Cerebral Ischemia in Rats

CHEN Fang-yuan,YU Min,ZHANG Li-xin,ZHANG Zhi-qiang.Rehabilitation Center,Shengjing Hospital,China Medical University, Shenyang,Liaoning 110022,China

ObjectiveTo observe the effects of instant hyperbaric oxygen(HBO)therapy on brain edema and aquaporin-4(AQP4)expression after cerebral ischemia in rats.Methods18 healthy adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=6), control group(n=6)and HBO group(n=6).Middle cerebral artery occlusion model was established with modified Longa method in the control group and HBO group.HBO was administered after cerebral ischemia immediately in HBO group for 60 min.They were observed with the neurological function score,brain tissue water content and AQP4 experssion 6 h after operation.ResultsCompared with the control group,the neurological score in HBO group improved significantly(P＜0.05),while the brain tissue water content and brain AQP4 expression decreased(P＜0.05).ConclusionHBO may improve the neurological function and brain edema after cerebral ischemia,which may relate with inhibiting the expression ofAQP4.

cerebral ischemia;hyperbaric oxygen;neurological score;brain edema;aquaporin-4;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.09.008

R743.3

A

1006-9771(2014)09-0823-04

2013-10-23

2013-11-27)

国家自然科学基金资助项目(No.81101462)。

中国医科大学附属盛京医院康复科，辽宁沈阳市110022。作者简介：陈方圆(1987-)，女，汉族，辽宁沈阳市人，硕士，医师，主要研究方向：高压氧治疗脑血管病。通讯作者：张志强，男，汉族，辽宁沈阳市人，主任医师，博士生导师，主要研究方向：物理因子治疗脑血管病。E-mail:zhangzq@sj-hospital.org。