和厚朴酚衍生物对肝癌细胞（HepG2）凋亡的影响

仇鲸翔 陈俐娟

（四川大学生物治疗国家重点实验室，四川 成都，610064）

我国常用中药材厚朴为木兰科植物厚朴（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）或凹叶厚朴的干燥干皮、根皮及枝皮，具有燥湿消痰、下气除螨之功效，用于食积气滞，腹胀便秘，痰饮喘咳等。现代药理研究表明，厚朴具有影响胃肠活动、抗菌、镇咳、肌肉松弛和中枢抑制等作用［1］。和厚朴酚（Honokio1）带有烯丙基的连苯二酚类化合物—是厚朴的主要化学成分。研究人员发现，和厚朴酚表现出多种药理作用，如抗炎、抗心律失常、抗癫痫［2］、抗血小板聚集等。此外，有研究报道和厚朴酚还可以抑制氮氧化产物和肿瘤坏死因子TNF的产生［2－4］。为了寻找和开发高效、低毒的抗肿瘤活性化合物，我们以和厚朴酚为母体，通过“Mannich反应”对其进行结构修饰，合成了数个和厚朴酚的衍生物，采用MTT法测试了和厚朴酚衍生物对不同肿瘤细胞的毒性作用，并进一步采用细胞流式分析手段研究了和厚朴酚衍生物对肝癌HepG2细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

和厚朴酚（Honokiol）购买于成都科华生物技术公司（纯度大于99%），和厚朴酚衍生物本实验室合成，合成过程参照本实验室的研究成果，同时略作修改［6］，用纯度大于99%的二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制成40μM的储存液备用，其中，DMEM及RPMI 1640培养基，胎牛血清（FBS）等试剂均购自兰州民海生物公司。四氮唑盐（MTT）：Sigma公司产品，使用前先用生理盐水配制成5g／L储存液，二甲基亚砜（DMSO）：Sigma公司产品，其余普通试剂均为国产的分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 化合物合成

某些酚类化合物可以和一分子甲醛及胺发生Mannich反应。根据实验室已有的研究结果［5］，我们通过微波促进的Mannich反应对和厚朴酚酚羟基临位进行修饰，合成了以下1＃H—6＃H衍生物。

1.2.2 细胞培养

HepG2细胞采用实验室的常规培养方法培养，该细胞于含10%胎牛血清、100U／mL青霉素和100mg／L链霉素的DMEM培养液中，置饱和湿度37度的5%CO2培养箱中培养。

1.2.3 MTT试验

取对数生长期的HepG2细胞单个核细胞，以5×104个细胞／孔的密度接种于96孔板中培养。实验组设立8个药物浓度组，每组HNK的终浓度为5、10、15、20、25、30、35、40μg／mL，每个药物浓度组设8个复孔。对照组加入同样浓度的二甲基亚砜（DMSO），每个剂量五个平行孔。分别于12、24、48小时取一块96孔培养板，板中每孔加入新鲜配制的浓度为5mg／mL的MTT 20μL。继续培养3h后取出培养板，小心吸弃培养基，每孔加DMSO 150 μL，轻轻震荡10分钟后，用酶标仪于490nm处测出各孔吸光度值OD，近下式计算细胞抑制率：根据公式：细胞抑制率（%）＝（1－给药孔平均OD值／对照孔平均OD值）×100%。

图1 1＃H—6＃H化合物的合成

1.2.4 用流式细胞仪检测Sub凋亡峰

收集药物作用后的HepG2细胞，用PBS洗一次，用预冷的70%乙醇于4度固定至少12h。离心后的细胞并用PBS冲洗、再用含50mg／L的PI，l g／L RNAase及0.1%Triton X－100的染料溶液冰浴避光孵育30min后。流式细胞仪分析。激发波长488nm，发射波长630nm。DNA含量少于正常二倍体细胞的亚二倍体细胞比率计为凋亡比率。

1.2.5 统计分析

实验数据采用Mean±SD表示，检测的调亡数据比例用SPSS 13.0软件中的ANOVA进行统计比较，主要检测各种数据间是否存在差异的显著性，P值小于0.05视为具有显著性差异。

2 实验结果

2.1 和厚朴酚衍生物抗增殖活性比较

为了比较和厚朴酚衍生物对肿瘤细胞抗增殖活性，我们采用MTT法测定了和厚朴酚及其衍生物对肿瘤细胞 HepG2、K562、SMMC－7221、LO2细胞增殖的影响。结果如表1和图2所示，从表1中可以看出，和厚朴酚3＃H衍生物的抗性最强，而6种衍生物的抗增殖活性存在剂量依存关系，这些剂量依存关系我们用软件分析后发现具有较好的剂量与效果的依存线性关系，这些线性关系表明和厚朴酚衍生物能够较好的抑制肿瘤细胞抗增殖。

表1 6个和厚朴酚衍生物对肿瘤细胞抗增殖活性

图2 和厚朴酚衍生物抑制HepG2细胞增殖检测结果

2.2 和厚朴酚衍生物对肿瘤细胞HepG2形态的影响

在显微镜下观察到正常HepG2细胞状态良好，均匀的贴附于培养板底面，而和厚朴酚衍生物3＃H作用细胞12h后，细胞皱缩，浮起变圆，核周边出芽，形成很多凋亡小体。

2.3 和厚朴酚衍生物诱导HepG2细胞发生凋亡的比率

在检测中发现，细胞发生凋亡，DNA断裂，染色体片段化，为了证明凋亡，并检测凋亡比率，可用流式细胞仪PI染色法分析。正常HepG2细胞无亚二倍体峰（G0／G1期）（3%），而加入和厚朴酚衍生物3＃H处理后，二倍体峰前面出现明显的凋亡特征的亚二倍体峰（29.4%）。经统计学检验表明与未经处理组有显著性差异。

3 讨论

细胞凋亡（apoptosis）即程序性细胞死亡是一种重要的生物学行为。细胞凋亡的形态学特征表现为细胞皱缩，与周围的细胞连接消失，胞质凝缩，细胞核固缩，细胞骨架解体，胞膜完整，最终形成膜包裹的凋亡小体，无内容物外溢，不引起炎性反应，凋亡小体可迅速被周围吞噬细胞吞噬。抗肿瘤药物通过抑制肿瘤细胞增殖与促进细胞凋亡来杀伤肿瘤细胞。

在本次实验中我们发现和厚朴酚衍生物体外抗肿瘤活性通过抑制肿瘤细胞增殖，阻断细胞周期，诱导细胞凋亡来实现。在这些化合物中和厚朴酚衍生物3＃H体外抗肿瘤活性最强。以前研究报道5－甲酰基可以显著增加和厚朴酚在K562、SPC－A1和A549上的抗增殖活性［6］。我们结果显示和厚朴酚衍生物3＃H极大地提高了和厚朴酚的抗增殖活性。在本实验中我们处理细胞24h后：和厚朴酚处理组只有1＃H这个厚朴酚衍生物的诱发细胞凋亡效果比较差外，其他和厚朴酚衍生物效果比较好。在实验中我们发现，1＃H既没有抑制细胞增殖也没有诱发细胞凋亡；2＃H、4＃H、5＃H和6＃H处理组与对照组相比显著抑制细胞的增殖，诱发细胞凋亡，细胞核形态出现凋亡特征；3＃H处理组大量的细胞从板底脱落，细胞核出现明显的凋亡特征：细胞核固缩，染色体凝缩，细胞核变得不规则出现月牙状。形态学和PI流式结果证实厚朴酚处理后HepG2细胞凋亡率增加。提示厚朴酚在小细胞肺癌治疗中具有应用价值。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：235.

［2］Liou，K.，Shen，Y.，Chen，C.，et al.，The anti－inflammatory effect of honokiol on nertrophils：mechanisms in the inhibition of reactive oxygen species production［J］.Eur.J.Pharmacol，2003，475：19－27.

［3］Liou，K.，Lin，S.，Huang，S.，et al.Honokiol ameliorates cerebral infarction from is chemia－reperfusion injury in rats［J］.Planta，Med，2003，69：130－134.

［4］Lin，Y.，Chen，H.，Ko，C.，et al.Differential inhibitory effects of honokiol and magnolo on excitatory amino acid－evoked cation signals and NMDA－induced seizures［J］.Neuropharmacology，2005，24.

［5］Liang Ma，Jinying Chen，Xuewei Wang，et al.Structural Modification of Honokiol，a Biphenyl Occurring in Magnolia officinalis：the Evaluation of Honokiol Analogues as Inhibitors of Angiogenesis and for Their Cytotoxicity and Structure Activity Relationship.J.Med.Chem.2011，54，6469－6481.

［6］Luo YF，Xu YB，Chen LJ，H u J，Peng C，Xie DC，Shi JY，Huan g WC，Xu GB，Peng M，Han J，Li R，Yan g SY，Wei YQ.Sem－i synthesis and an t－i proliferative activity evaluation of novel analogues of Honok iol.Bioorg.Med.Chem.Lett.2009；19：4702－05.