雷公藤红素对裸鼠肝癌皮下移植瘤抑制作用的研究

李景源 吴刘成 郑波 邵义祥

作者单位：226001 南通 江苏南通大学比较医学研究所

基础研究

雷公藤红素对裸鼠肝癌皮下移植瘤抑制作用的研究

李景源 吴刘成 郑波 邵义祥

作者单位：226001 南通 江苏南通大学比较医学研究所

目的 研究天然活性化合物雷公藤红素（celastrol）对裸鼠移植肿瘤的抑制作用。方法建立人源肝癌HepG2细胞的裸鼠皮下移植肿瘤模型。20只裸鼠随机分为4组，即空白对照组和雷公藤红素高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组分别按4.0 mg/kg、2.0 mg/kg、1.0 mg/kg雷公藤红素腹腔给药，每日一次，每周5 d，共给药30 d，实验中每5 d测量一次肿瘤体积的变化。结果 雷公藤红素高剂量组、中剂量组和低剂量组的体积抑瘤率分别是89.52%、65.60%和12.21%，与空白对照组相比，高剂量组、中剂量组的差异具有统计学意义（P＜0.05）。高剂量雷公藤红素给药后对裸鼠肝脏和肾脏等产生严重的毒性反应。结论 雷公藤红素对裸鼠肝癌皮下移植瘤具有良好的体内抗肿瘤效果，应进一步开展药物新剂型及分子结构优化方面的研究，减少其毒副反应。

肝肿瘤；雷公藤红素；肝癌皮下移植瘤模型；抑制；毒性

雷公藤红素（celastrol），别名南蛇藤素，是从卫矛科植物雷公藤tripterygium wilfordii Hook.f.的根、叶及花中提取的、具有多种生物活性的活性单体之一，属醌甲基三萜类色素，因其具有确切的抗炎、免疫抑制及抗癌作用而受到越来越广泛关注［1，2］。中美科学家合作研究表明，雷公藤红素作为一种蛋白酶体抑制剂具有出色的抗肿瘤效果，抑瘤率高达65%～93%，远高于目前国际市场上畅销的紫杉醇注射液［3］。研究表明，诱导肿瘤细胞凋亡可能是雷公藤红素抗肿瘤作用的主要机制。我们的前期体外实验研究也表明，雷公藤红素具有显著的抗肿瘤活性，对白血病（K562）细胞、肺癌（A549）细胞以及肝癌（HepG2）细胞等多种肿瘤细胞均有抑制作用［4，5］。为了进一步研究雷公藤红素在体内的抗肿瘤活性，本研究将人源肝癌HepG2细胞移植于裸鼠皮下，建立裸鼠肝癌皮下移植肿瘤动物模型，探讨雷公藤红素的体内抗肿瘤活性，以及对部分正常器官、组织的毒副反应。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

DMEM高糖培养基（GIBCO，USA）；小牛血清（杭州四季青生物工程公司）；胰蛋白酶（Amresco，USA）；双抗（Amresco，USA）；雷公藤红素（广州牌牌生物科技有限公司）；苏木素染色液和伊红染色液（海门市碧云天生物技术研究所）；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 实验动物

选用BALB/c-nu裸小鼠，雌性，体重为22~24 g，鼠龄5~7周，SPF级，共30只。由南通大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证：SCXK（苏）2008-0010，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2012-0031。饲料、饮水和笼具等均经高压灭菌和紫外线消毒后使用。饲养级别为SPF级屏障环境。

1.3 HepG2肝癌细胞的体外培养

HepG2肝癌细胞购自中国科学院上海细胞库，常规培养于含10%小牛血清的DMEM高糖培养基中，置于5%CO2、37℃细胞培养箱内传代培养。

1.4 BALB/c-nu裸小鼠肿瘤动物模型的建立

取对数生长期的HepG2细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，去上清液，离心洗涤2次，细胞计数并配制约为3×107/ml的细胞悬液。取上述细胞悬液0.3 ml，用1 ml注射器将细胞接种到裸小鼠右腋下皮下组织。接种后正常饲养，观察裸鼠的生长情况，待皮下生长出可触及的、直径为3 mm左右的瘤块时，剔除瘤块直径最大和最小的裸鼠，建立裸鼠皮下移植瘤模型。

1.5 实验动物分组及给药

采用随机分组的方法，将经过筛选的20只荷瘤裸小鼠分成4组，每组5只。即空白对照组；高剂量组，雷公藤红素4.0 mg/kg；中剂量组，雷公藤红素2.0 mg/kg；低剂量组，雷公藤红素1.0 mg/kg。分组后开始给药，雷公藤红素用DMSO助溶后再以PBS稀释至所需浓度，采用腹腔内注射给药方法分组给药，每日一次，每周5 d，共给药30 d。给药后裸鼠正常饲养。

1.6 荷瘤裸鼠生长情况的观察和测量肿瘤大小

定期观察荷瘤裸鼠精神、饮食和排便状况。以开始投药前所测肿瘤体积为基准，每隔5 d测量荷瘤裸鼠体重，并用游标卡尺测量肿瘤的最长径和最短径，共6次。肿瘤体积的计算公式：V=长径×短径×短径/2，计算其平均值并绘制肿瘤体积生长和体重变化图。

1.7 肿瘤标本的组织学处理

将荷瘤裸鼠于给药后第31天脱臼处死。观察移植瘤的形态，并取出肿瘤，称重，置于4%多聚甲醛中固定，逐级脱水后，制成4 μm石蜡切片，经过HE染色后中性树脂封片，晾干后于倒置显微镜下观察。

1.8 统计学分析

所有实验数据均通过SPSS 16.0统计学软件进行处理。计量资料用（±s）表示，多组间样本均数的比较采用具有重复测量的两因素方差分析进行数据分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 荷瘤裸鼠及肿瘤的生长状况

在给药之前，荷瘤裸鼠的体重随时间呈缓慢增加的趋势，肿瘤体积也逐渐增大，生长速率略有差别。肿瘤形态呈球形或不规则团块状，边界较清楚，有活动性，有部分轻微浸润皮肤，说明裸鼠的皮下移植肿瘤模型建模成功。给药初期，荷瘤裸鼠活动正常。给药10 d后，中剂量组和高剂量组的药物开始对荷瘤裸鼠产生一定的毒副反应，体重减轻。至实验接近结束时，中剂量组和高剂量组药物的毒副反应明显，荷瘤裸鼠的行动迟缓、厌食，体重明显减轻。

2.2 肿瘤体积的生长变化与比较

在对荷瘤裸鼠给药后，每隔5 d用游标卡尺记录各组荷瘤裸鼠肿瘤的体积。实验结束时，雷公藤红素高剂量组、中剂量组和低剂量组的体积抑瘤率分别是89.52%、65.60%和12.21%。如图1所示，随着雷公藤红素剂量的增加，对肿瘤的生长抑制率也随之变大，存在剂量依赖性关系。采用具有重复测量的两因素方差分析对多组样本均数进行比较，F=5.90，P=0.0055，差异具有统计学意义，显示空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组4个组中的肿瘤体积的总体均数不全相同；进一步用最小显著差法（LSD-t）对组间两两进行比较，结果显示与空白对照组相比，低剂量组差异无统计学意义，而中剂量组和高剂量组的差异均具有统计学意义（P均<0.05）。见表1。

2.3 荷瘤裸鼠体重的变化情况及比较

实验初期，各组荷瘤裸鼠生长状况良好。如图2所示，对于空白组和低剂量组的荷瘤裸鼠，实验过程中未观察到明显的毒副反应。而对于高剂量组药物干预的荷瘤裸鼠，在实验的后期，荷瘤裸鼠的体重明显减轻。采用具有重复测量的两因素方差分析对多组样本均数进行比较，F=5.71，P=0.0063，差异具有统计学意义。表示空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组4个组中的荷瘤裸鼠体重的总体均数不全相同；进一步用最小显著差法（LSD-t）对组间进行两两比较，结果显示：与空白对照组荷瘤裸鼠相比，高剂量组荷瘤裸鼠体重的变化具有统计学意义（P<0.05），而中剂量组和低剂量组荷瘤裸鼠体重的变化均无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。提示高浓度雷公藤红素对荷瘤裸鼠的正常生长有较大影响，具有较大的毒副反应。

图1 不同实验组荷瘤裸鼠肿瘤体积变化情况

图2 不同实验组荷瘤裸鼠体重变化情况

表1 不同实验组荷瘤裸鼠肿瘤体积变化的比较（±s，mm3）

表1 不同实验组荷瘤裸鼠肿瘤体积变化的比较（±s，mm3）

分别与空白对照组比较，△P＞0.05;*P＜0.05。

组别 给药前 第5天 第10天 第15天 第20天 第25天 第30天 F P空白对照组 16.49±18.07 56.51±20.04 133.12±32.66 224.18±32.41 332.50±45.50 523.40±14.06 836.74±40.05 - -低剂量组 15.23±21.26 48.23±13.77 78.63±25.35 113.34±12.13 194.40±38.71 440.90±57.02 734.53±62.04 1.06 0.318△中剂量组 14.75±20.42 28.13±19.01 52.59±24.12 76.08±33.23 100.72±23.58 164.67±45.58 287.85±43.64 8.34 0.010*高剂量组 13.94±15.36 19.43±10.17 24.06±11.63 32.01±20.05 50.66±16.18 69.00±20.85 87.67±26.37 3.77 ＜0.001*

表2 不同实验组荷瘤裸鼠体重变化的比较（±s，g）

表2 不同实验组荷瘤裸鼠体重变化的比较（±s，g）

分别与空白对照组比较，△P＞0.05；*P＜0.05。

组别 给药前 第5天 第10天 第15天 第20天 第25天 第30天 F P空白对照组 23.00±0.28 23.40±0.56 23.45±1.06 24.05±1.06 23.80±0.42 24.10±1.35 24.45±0.49 - -低剂量组 22.00±0.56 22.45±0.21 22.30±0.28 22.10±0.98 22.65±0.63 22.26±0.73 22.65±0.63 3.98 0.065△中剂量组 23.70±0.56 23.65±0.21 23.35±0.35 22.75±0.07 22.50±0.84 21.50±0.98 19.50±0.56 3.55 0.076△高剂量组 23.80±0.42 23.25±0.35 22.05±0.63 20.50±0.82 19.90±0.70 18.50±0.84 16.75±0.63 4.13 ＜0.001*

2.4 4组荷瘤裸鼠肿瘤的重量比较

实验结束后，将4组荷瘤裸鼠取出肿瘤组织，剔除结缔组织后称重。对4组荷瘤裸鼠肿瘤重量进行比较，显示空白对照组荷瘤裸鼠肿瘤最重［（245.95±20.09）mg］，而雷公藤红素高剂量组的肿瘤重量最轻［（30.50±13.38）mg］。根据肿瘤重量计算抑瘤率，高剂量组为87.60%；中剂量组为64.87%，低剂量组为22.77%，与空白对照组的肿瘤重量比较，中剂量组和高剂量组的差异均具有统计学意义（P均＜0.05），这与上述3个剂量组体积抑瘤率的结果基本一致。显示肿瘤重量的降低与雷公藤红素的给药浓度呈明显的剂量依赖性。

2.5 荷瘤裸鼠肿瘤组织及肝肾组织HE染色检查结果

2.5.1 肿瘤组织 实验结束后，取出荷瘤裸鼠肿瘤组织并经石蜡切片后用HE染色。如图3所示，空白对照组肿瘤组织完整，雷公藤红素低剂量组、中剂量组、高剂量组的肿瘤组织的损坏程度呈增强趋势。特别是中剂量组和高剂量组，肿瘤组织坏死现象严重，出现大片状坏死，肿瘤细胞凋亡较多。可见雷公藤红素对肿瘤组织产生一定的细胞毒性，且其对肿瘤组织的破坏程度随给药剂量的增加而增强。

2.5.2 肝、肾组织 本实验重点考察了雷公藤红素对荷瘤裸鼠肝脏和肾脏产生的影响。如图4和图5所示，通过观察比较可以看出，空白对照组和低剂量组荷瘤裸鼠的肝、肾组织的细胞基本没有损伤，而中剂量组和高剂量组荷瘤裸鼠的肝、肾组织受到一定程度损坏，特别是高剂量组的肾组织出现细胞损坏的程度较大。由此可见，随着雷公藤红素用药剂量的增加，雷公藤红素对荷瘤裸鼠的肝脏和肾脏产生较严重的毒副反应，对组织器官产生一定的损害。

3 讨论

源于传统中药的天然活性化合物在癌症的治疗以及新药研发中发挥着越来越重要的作用。雷公藤红素是我国首先从雷公藤根中提炼出来的三萜类活性单体，是雷公藤提取物的主要活性成分之一。雷公藤红素具有显著的抗癌活性，在治疗人类癌症方面具有巨大的潜力和应用前景［6，7］。雷公藤红素是热休克蛋白Hsp90信号通路的调节剂［8，9］，且能够使SHG-44细胞bax的表达增加，bcl-2的表达下降，促进肿瘤细胞凋亡［10］。另外，雷公藤红素能够促使人急性髓系白血病HL-60细胞中NF-κB基因表达的下调，并且可上调Fas、FasL基因的表达［11］。雷公藤红素能够经由caspase依赖和caspase非依赖两种途径来诱导人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡，诱导细胞色素c、AIF等线粒体凋亡蛋白从线粒体释放到细胞质基质［12］。在原代培养的人脐静脉内皮细胞HUVEC和人前列腺癌PC-3细胞［13］、SHG44胶质瘤细胞［14］等细胞中，雷公藤红素可以抑制血管内皮生长因子（VEGF），从而抑制VEGF诱导的细胞增殖、迁移和入侵等过程。

图3 荷瘤裸鼠肿瘤组织HE染色检查的结果（HE×200）

图4 荷瘤裸鼠肝组织HE染色检查的结果（HE×400）

图5 荷瘤裸鼠肾组织HE染色检查的结果（HE×400）

目前关于雷公藤红素的体内抗肿瘤活性以及组织毒性等评价试验相对较少。有报道称，雷公藤红素在SHG44胶质瘤裸鼠的抑瘤试验中，雷公藤红素4 mg/kg组和2 mg/kg组的体积抑瘤率分别为35.0%、26.9%［15］。另外，植入人神经胶质瘤的裸鼠体内试验结果表明，雷公藤红素可以抑制VEGF受体1和VEGF受体2的表达和转录，这可以说明阻断VEGF受体的表达是雷公藤红素抑制肿瘤细胞生长的主要机制［16］。有报道表明，在人源肺癌（95-D）细胞建立的裸鼠模型实验中，将雷公藤红素与伏立诺他（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）联合应用能够显著抑制肿瘤的生长，当单独注射雷公藤红素（0.5 mg/kg）或SAHA（100 mg/kg）时，抗肿瘤效果不明显，当联合注射两种药物时，其体积抑瘤率达到70.3%，并且小鼠体重未减轻，毒性较小［17］。

本实验中，我们将HepG2肝癌细胞接种于裸鼠皮下，建立皮下移植肝癌动物模型，研究了雷公藤红素在体内的抗肿瘤活性，并初步探讨了雷公藤红素对部分组织器官的毒性作用。通过实验数据分析，雷公藤红素对肿瘤组织具有明显的生长抑制作用，且存在剂量效应的依赖性。雷公藤红素高剂量组、中剂量组和低剂量组的体积抑瘤率分别是89.52%、65.60%和12.21%，与空白对照组相比，高剂量组、中剂量组均具有统计学意义（P均＜0.05）。同时，通过对荷瘤裸鼠部分组织器官的组织学观察，显示雷公藤红素对荷瘤裸鼠肝脏和肾脏等组织器官存在一定的毒副反应，特别是在中剂量、高剂量给药时毒副反应更为明显，这将限制其在临床治疗的实际应用，因此如何降低其对正常组织细胞的毒副反应，仍需进一步研究。深入探讨对化合物结构的改造及新剂型的研发等将是今后研究工作的重要方向。

4 小结

本实验通过裸鼠皮下移植肿瘤模型的体内试验，表明雷公藤红素对HepG2细胞的皮下移植肿瘤具有明显的生长抑制作用，并呈剂量依赖性。同时，高剂量给药时，雷公藤红素对荷瘤裸鼠肝脏和肾脏等正常器官组织有一定的毒副反应。深入分析药物的抗肿瘤效果和对正常组织的毒性作用，将为雷公藤红素的药效学研究提供可靠的实验依据。

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［2014-07-29收稿］［2014-08-20修回］［编辑 阮萃才］

Celastrol-mediated growth inhibition of subcutaneously transplanted hepatocarcinoma in nude mice

LI Jing-yuan，WU Liu-cheng，ZHENG Bo，SHAO Yi-xiang（Institute of Comparative Medicine，Nantong University，Nantong 226001，P.R.China）

SHAO Yi-xiang.E-mail：shaoyx@ntu.edu.cn

Objective To study the potential of celastrol to inhibit growth of transplanted tumors in nude mice.Methods Nude mice（n=20）subcutaneously injected with HepG2 cells were randomly divided into 4 groups and treated by abdominal injection with 0，1.0，2.0 and 4.0 mg/kg once daily five times per week.Tumor size was measured every five days.Results Tumor volume inhibition was 12.21%for 1.0 mg/kg，65.60%for 2.0 mg/kg and 89.52%for 4.0 mg/kg，and tumor volume was significantly smaller in animals treated with 2.0 or 4.0 mg/kg than in control animals.Severe liver and kidney toxicity were observed in animals treated with 4.0 mg/kg. Conclusion Celastrol shows good anticancer activity in this mouse model of liver cancer.Studies are needed to optimize dosing and drug structure to reduce toxicity.

Liver neoplasm；Celastrol；Liver cancer model；Inhibition；Toxicity

R735.7

A

1674-5671（2014）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.03.03

江苏省高校自然科学研究面上项目（13KJB310015）；南通市科技计划项目（BK2013045）；南通大学引进人才科研启动基金资助项目（13R30）；南通大学自然科学科研基金助项目（13ZY008）

邵义祥。E-mail：shaoyx@ntu.edu.cn