苏铁叶枯病病原菌鉴定

李小霞　肖仲久　许艾斌　徐刚红

摘 要 近年在贵州省苏铁各栽培地发现一种叶枯病害，为明确其致病菌，采集苏铁叶枯病叶片样本数份，并对病原菌进行形态观察、致病性测定及rDNA-ITS序列分析。结果表明：经分离纯化获得的病原菌，通过柯赫氏法则，接种后出现的病害症状与直接采集到的病害标样症状一致，确定其为致病菌；对病原菌进行传统的形态学观察，结果显示病原菌分生孢子器和分生孢子的形态与拟茎点霉一致；将待测菌株rDNA-ITS序列与GenBank中相关菌株ITS序列进行同源性比较，结果显示该菌株与Phomopsis vaccinii（GenBank登陆号为：KC488259，JX846914）的同源性达97%。结合病原菌形态学特征及株rDNA-ITS序列（GenBan登录号：JN417709）特征，确定苏铁叶枯病病原菌为Phomopsis cycadis.

关键词 苏铁；拟茎点霉；病原菌

中图分类号 S791.11 文献标识码 A

Abstract Leaf blight on Cycas revoluta Thunb was discovered in Guizhou Province recently. The objective of the study was to identify the pathogen. The Cycas Leaf blight standard samples were collected and the pathogen was identified by morphology， pathogenicity and ribosomal DNA-ITS. The results showed that the isolated fungus was used for departments law of disease and syndrome. Disease symptoms after inoculation were the same as that on the collected samples，which showed the fungus was the pathogen. The pycnidia and conidiamorphology of the pathogen were similar to that of Phomopsis. Comparing the measured sequence with the related sequence of Phomopsis vaccinii（No：KC488259，JX846914） in GenBank， the homology was 97%. According to its characteristics of morphology and sequence analysis of the internal transcribed spacer region of the ribosomal DNA（ITS）（No：JN417709）the pathogen was identified as Phomopsis cycadis.

Key words Cycas revoluta Thunb；Phomopsis；Pathogen

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.030

苏铁（Cycas revoluta Thunb.）系苏铁科苏铁属常绿乔木，起源于3亿年前的晚石炭纪，是现存最古老最原始的种子植物之一[1-3]，是国家一级重点保护植物，其树型优雅，叶片别致，其性味甘、平、涩，有小毒，具有体外抑制肿瘤细胞增殖的作用等，因此，常将其水煎剂用于治疗多种肿瘤，是中国传统观的赏树种和药用植物[4-6]。而随着苏铁的观赏价值和药用价值越来越受到人们的重视，其栽植规模越来越大，随之而来的是病害的发生越来越严重，直接影响到植株的生长，进而影响其观赏价值。目前国内对于苏铁叶枯病的研究多针对炭疽菌（Colletotrichum）和橄榄色盾壳霉（Coniothyrium olivaceum）所致的叶枯病[7-8]，拟茎点霉引起的苏铁叶枯病还未见报道。

拟茎点霉属[Phomopsis（Sacc.）Bubák.]真菌是半知菌亚门腔孢纲真菌。一般侵染植物的叶、枝及果，常引起的植物病害症状主要有溃疡、烂茎、果腐，叶枯、枝枯等[9-10]，危害较大，寄主广，种类多，但由于种间形态差异小，常见以寄生植物属内拟茎点霉的形态比较来进行种类鉴定或命名，据报道该属寄主植物有74个科136个种[11]。

2009～2013年，在贵州城市苏铁盆景、遵义植物园、习水国家自然保护区等地调查发现，苏铁叶枯病大面积发生，严重的导致整株枯死。因此，本实验室连续几年分批采集了上百份自然发病的标样，并进行形态学和分子生物学鉴定，为苏铁叶枯病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 病害标本的采集

2009～2013年每年的5～8月，每个采集点（贵州省植物园、遵义植物园、安顺市植物园、遵义师范学院盆景植物园）月均1次，分别采集发病的苏铁叶片标样。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离、纯化及致病性的测定 采集自然发病的苏铁叶片，以常规组织法[12]进行病原菌的分离。将分离菌株纯化后，取健康苏铁叶片进行室内接种试验：将采集的苏铁叶片用75%酒精进行表面消毒，采用有伤（刺伤法）接种和无伤接种2种方法，每个叶片接种2个接种点，每个供试菌株接种3片叶片。实验组接种已纯化的5 mm的菌饼，对照组接种5 mm无菌的PSA培养基，将其置于铺有湿润吸水纸的培养皿中，于25 ℃、光照1 500 lx的光照培养箱中培养，观察接种结果，并对接种成功的病斑进行组织分离，以确认致病菌株[4]。

1.2.2 病原菌的孢子、菌丝形态观察及形态学鉴定 按照柯赫氏法则，在确定致病性后，用针尖从标本上挑取小黑点（分生孢子器），在光学显微镜下观察分生孢子器和分生孢子的形态，并测量其大小。25 ℃、PSA平板上培养菌株数天，记录菌落的培养性状。

1.2.3 病原菌DNA提取 DNA的提取，参照Sharp等[13]、Xiao等[14]的方法，并略有改进。取约0.2 g菌丝，置于预冷的研钵中，加入少许石英砂研磨至粉状，再加入600 μL的2% CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动后，置于2 mL的灭菌离心管中，65 ℃的水浴30～60 min，期间每隔10 min上下轻轻颠倒，混匀离心管内的缓冲液1～2次；冷却2 min后，加入（酚 ∶ 氯仿 ∶ 异戊醇）（V∶ V ∶ V 25 ∶ 24 ∶ 1）至满管，使二者混合均匀，4 ℃离心（12 000 r/min）10 min；重复该步骤2～3次直至水相与有机相中间层无杂质；离心后取上清液至新离心管内，加入600 μL预冷的异丙醇，慢慢上下摇匀30 s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；置于4 ℃离心（12 000 r/min）， 10 min后，弃上清液，晾干；加入1 mL 75%乙醇漂洗DNA，7 500 r/min再离心5 min，倒掉上清液，室温晾干；加入30 μL无菌水，4 ℃过夜溶解后，-20 ℃保存备用。

1.2.4 rDNA-ITS区域核苷酸序列测定 选用真菌ITS扩增的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGC

GG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行

配对扩增[14]（引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）。反应结束后，取5 μL扩增产物，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，Tiangen的DNA凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将测得的ITS序列在NCBI网站中进行同源性分析，分析后向GenBank提交序列，再从GenBank中选取合适的序列，经CLUSTALW 2.0软件进行序列对比，并用MEGA 5.05软件采用邻接法（Neighbor-joining analysis，NJ）构建系统发育树，其中Bootstrap检验的重复次数为1 000次。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离

将采集的样本经分离纯化后，共获得苏铁叶部病原菌菌株15株，编号为P01-15。其中，P01、04、08、09回接后为非致病菌，其它菌株形态特征基本一致，选取菌株P03为代表（标本采自遵义植物园），按柯赫氏法则进行致病性测定和病原菌鉴定。

2.2 致病性的测定

接种48 h后，刺伤接种处出现褐色水渍状病斑；随着接种时间的延续，褐色水渍状病斑上下扩展；接种后第8天，叶片出现干枯；接种后第13天，出现埋生的黑色分生孢子器；接种15 d后，人工接种叶片几乎全叶变为褐色（图1），与自然发病症状一致。对其进行病原菌分离培养，其分离物与接种供试菌株培养性状相同，由此可见，供试菌株为苏铁叶枯病的致病菌。无伤接种和对照接种后无病斑出现。

2.3 病原菌形态学的鉴定

自然发病的病叶一般发生在叶尖或中部，初为梭形、圆形、不规则形，黄褐色，边缘灰白色，逐渐向叶柄扩展，引起叶尖干枯，后期病部散生黑色小点（分生孢子器）（图2）。分生孢子器球状至扁球形，埋生于叶面，大小为255～423 μm（n=30），器壁黑褐色，孔口明显（图3），分生孢子梗无色、分隔、簇状或合轴分枝，11～25×1.7～2.6 μm。轻轻压迫分生孢子器，内涌出甲型（α型）分生孢子，无色，纺锤形，单胞，内含1～3个油球，一般为2个，大小为5.14～10.8×1.9～4.4 μm（n=30）（图4）。寄主植物上未分离到乙型（β型）分生孢子。新鲜标样进行分离纯化后，在25 ℃、PSA培养4 d后，菌丝辐射状生长，菌丝的正反面均为白色、绒毛状，菌丝平板上呈现“深-浅-深”的轮纹（图5）；6 d后菌丝的反面出现轮状黑色小点（图6）；15 d后正面出现黑点状的分生孢子器（子实体），排列在同心圆的边缘（图7）。30 d后黑色的子实体中喷射出黄色的分生孢子，取其黄色分生孢子置于玻片上，在光学显微镜下观察分生孢子性状。分生孢子器内产生2种类型的分生孢子，除有在寄主上看到的无色的甲型分生孢子外，还有乙型分生孢子，无色，线性，内无油球，单胞，有些一端弯曲呈钩状，有些稍有弯曲，大小为15.36～51.2×0.7～1.28 μm（n=30）（图8），经初步形态鉴定为拟茎点霉属Phomopsis真菌。

2.4 rDNA-IT区域核苷酸序列的测定与分析

菌株用ITS区域通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，结果可得到1条600 bp左右的条带（图9），回收目的片段进行测序，结果大小为527 bp。将测序得到的序列与GenBank中已有的DNA序列进行同源性比对，菌株P03（GenBan登录号：JN417709）与分离自中国山东的蓝莓拟茎点枝枯病病原菌Phomopsis vaccinii（GenBank登陆号为：KC488259，JX846914）同源性最高，达97%，分值为891。系统发育分析结果表明，在以Leucostoma curreyi（Accession No. AF191172）为外群构建的系统发育树中，目标病原菌与分离自蓝莓的拟茎点霉菌株遗传距离最近（图10）。但苏铁叶枯病病原菌并非P. vaccinii，结果鉴定为苏铁拟茎点霉Phomopsis cycadis。

3 讨论与结论

拟茎点霉是重要的植物内生真菌和资源真菌，但也是一种重要的植物病原真菌，诸多报道其引起多种植物叶、茎、枝等病害[7-8，15]。为明确引起贵州苏铁叶枯病病原菌，本课题组通过病原菌培养特性观察，确认引起贵州省苏铁叶枯病病原菌为拟茎点霉Phomopsis属真菌，国外曾经有关于苏铁叶枯病方面的报道，对该病的病原菌也有不同的报道，有刺盘孢Colletotrichum sp.、拟茎点霉Phomapsis、拟盘多毛孢Pestalopsis sp.。Phomopsis cycadis最初发表于1954年[16]，在此之前一直采用茎点霉Phoma cycadis[17]，国内几乎无拟茎点霉Phomapsis引起的苏铁叶枯病病原菌的报道。通过 rDNA ITS 序列比对分析，结果发现该病原菌与分离自山东的2株P. vaccinii同源性最高（97%）。rDNA-ITS 构建的系统进化树显示，P. cycadis和P. vaccinii分处于不同的分支，支持率达98%，同时比较两者的致病性特点及病原菌形态特征，结果发现两者差异明显，P. vaccinii的分生孢子器直径一般 300～500 μm，甲型分生孢子大小为 6～11×2～5 μm[18-19]，比本菌分生孢子器大，而且其甲型分生孢子稍宽，因此，可判别苏铁叶枯病病原菌并非P. vaccinii。另外，P. vaccinii主要寄生于杜鹃花科越桔属蓝莓（Vaccinium）植物上，可通过花芽和伤口侵入。本研究在病原菌致病性实验中发现，伤口对于P. cycadis入侵寄主尤为重要，无伤接种无病斑出现，因此，在苏铁的栽培中，农事操作过程减少造成苏铁叶片伤口是减少该病菌危害的重要手段。

因此，基于病原菌形态特征和rDNA ITS序列分析，将引起贵州遵义等地的苏铁叶枯病的病菌鉴定为苏铁拟茎点霉P. cycadis。

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