三倍体枇杷茎尖培养与植株再生

陶炼等

摘 要 以三倍体枇杷茎尖为外植体，研究了取材时间及茎尖大小、植物生长调节剂对三倍体枇杷茎尖培养与植株再生过程中萌发、伸长、生根及移栽的影响。结果表明：春季取材且茎尖大小为0.7 cm时，茎尖成活率最高，为77.5%；初代培养适宜培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.5 mg/L，在此培养基上，三倍体枇杷茎尖萌发率高达91%；茎尖伸长适宜培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 0.3 mg/L，平均芽苗高度可达4.9 cm；芽苗增殖适宜培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+Tryptone 750 mg/L，增殖系数为7.7；生根适宜培养基为1/2MS+NAA 0.25 mg/L+IBA 2.0 mg/L，生根率为73.3%；三倍体枇杷组培苗移栽入腐熟有机肥 ∶ 园土 ∶ 锯末（1 ∶ 2 ∶ 1）的基质中成活率达到93.67%。

关键词 三倍体枇杷；茎尖培养；植株再生

中图分类号 S667.304 文献标识码 A

Abstract Plant regeneration was completed for the first time using shoot tips as the explants harvested from a triploid mother plant in loquat. A series of experiments were carried out to investigate the effects of sampling time and the size of the explants，growth regulators on shoot tip sprouting，elongation，rooting and transplantation. The results showed that sampling in spring and shoot-tip size of 0.7 cm were appropriate，resulting in a survival rate of 77.5%. Appropriate initial culture medium was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L，in which the sprouting rate reached 91%. Suitable medium for shoot elongation was MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 0.3 mg/L，which resulted in an average shoot height of 4.9 cm. The most suitable medium for shoot proliferation was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+Tryptone 750 mg/L，in which a high multiplication coefficient of 7.7 was obtained. The most suitable medium for rooting was 1/2MS+NAA 0.25 mg/L+IBA 2.0 mg/L，in which the rooting rate was 73.3%. The rooted plantlets，after hardening，survived at a rate of 93.67% in the transplantation matrix of decomposed organic fertilizers，garden soil and sawdust（1 ∶ 2 ∶ 1）under careful temperature and water management.

Key words Triploid loquat； Shoot tip culture； Plant regeneration

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.025

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）系蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科（Maloideae）枇杷属（Eriobotrya）植物，原产中国西南（四川雅安市境内大渡河流域），已有2100多年的栽培历史[1]，中国是世界枇杷的自然分布中心和栽培中心[2]。

枇杷果实中种子的重量约占果重的1/3，可食率不高，严重影响了枇杷的食用价值与商品价值[3]。因此，国内外科研人员长期致力于提高果实可食率的枇杷品种改良和新品种选育工作，其中重要途径之一就是通过创制枇杷三倍体材料来培育无籽品种。至今，全世界创制出三倍体枇杷材料且尚有种质保存的仅有西南大学的梁国鲁和四川农业大学的王永清，梁国鲁的策略是从大量种子实生苗海选获得天然枇杷三倍体[4]，王永清则另辟蹊径，从控制授粉获得的枇杷小种子植株中，获得了高频率的枇杷三倍体[5]。然而，三倍体枇杷因染色体组的原因表现出育性较低，在不施用生长调节物质的情况下坐果率较低，果实较小，商品性较差[6]，而利用转基因技术对三倍体枇杷进行遗传改良，减少其对外源生长调节物质的依赖，提高其坐果率，改善果实商品性则具有重要的理论和现实意义。

近年来，利用茎尖分生组织再生体系作为受体进行遗传转化在多种植物上已成功应用[7-10]。在枇杷上，二倍体材料茎尖培养和植株再生研究已取得一定进展[11-12]，三倍体枇杷茎尖培养由于茎尖茸毛多，酚类物质含量高等问题，再生难度大，至今未见任何报道。因此，本研究以四川农业大学自主创制的三倍体枇杷为材料，旨在建立三倍体枇杷茎尖培养和植株再生体系，为利用转基因技术对三倍体枇杷进行遗传改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究以四川农业大学自主创制的三倍体枇杷（2n=3x=51）为材料（图版Ⅰ-A），取其茎尖为外植体。

1.2 方法

1.2.1 初代培养 最佳取材时间及茎尖大小的筛选：分别选取春、夏、秋、冬梢茎尖为外植体，用75%酒精处理20 s，0.1%升汞处理8 min，无菌水冲洗多次后，将茎尖分为3个大小（0.4、0.7、1.0 cm），接种于MS基本培养基中，采用两因素完全实验设计，每组处理接种60个外植体，重复3次，14 d后统计褐化率（褐化的外植体数/接种的外植体数×100%）、污染率（污染的外植体数/接种的外植体数×100%）、成活率（成活的外植体数/接种的外植体数×100%），找出最佳的取材时期和茎尖大小。

初代培养基中生长调节剂的筛选：采用筛选出的外植体取材时期和茎尖大小，以MS为基本培养基，分别添加不同浓度的6-BA（1.0、2.0、3.0）mg/L、NAA（0.1、0.25、0.5）mg/L和IBA（0.5、1.0、1.5）mg/L，采用三因素三水平正交实验设计，培养基中均附加琼脂7.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH5.8，每处理接种60个外植体，重复3次。接种后定期观察茎尖生长状况，30 d后统计萌发率（萌发的外植体数/成活的外植体数×100%）及平均芽苗高度。

1.2.2 芽苗伸长培养 将初代培养获得的芽苗转移到伸长培养基上，伸长培养基以MS为基本培养基，分别添加不同浓度的6-BA（0.5、1.0、1.5）mg/L，NAA（0.1、0.2、0.3）mg/L，GA3（0.1、0.2、0.3）mg/L，采用三因素三水平正交实验设计，培养基中均附加琼脂7.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH5.8，每处理接种60个外植体，重复3次，接种后定期观察芽苗生长状况，30 d后统计芽苗高度及长势。

1.2.3 芽苗增殖培养 将长1.0 cm左右的芽苗接种于增殖培养基上。增殖培养基以MS为基本培养基，分别添加不同浓度的6-BA（0.5、1.0、1.5）mg/L、NAA（0.1、0.3、0.5）mg/L和胰蛋白胨（250、500、750）mg/L，采用三因素三水平正交试验设计，培养基中均附加琼脂7.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH5.8，每处理接种60个外植体，重复3次，接种后观察并记录芽苗增殖及长势情况，培养30 d后统计增殖系数（≧0.5 cm丛生芽数/接种芽苗数）和芽苗长势。

1.2.4 生根培养 当芽苗长至2 cm左右时，经切割后转入生根培养基上，生根培养采用三因素三水平的正交试验设计，基本培养基为（MS、1/2 MS、1/4 MS），IBA为（0、1.0、2.0）mg/L、NAA为（0、0.25、0.5）mg/L，培养基中同时附加琼脂7.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH5.8，每处理接种60个外植体，重复3次，接种10 d后开始观察记录生根情况，30 d时统计生根率（生根芽苗数/接种芽苗数×100%）、生根芽苗根数、平均根长，并观察生根苗长势。

1.2.5 炼苗和移栽 当生根苗长出3～5条根时即可进行炼苗移栽，方法是在培养室揭去封口膜培养3 d，然后取出试管苗洗去培养基，移栽到含有不同配比的基质中，每种基质移栽30株，重复3次，常规管理，30 d统计移栽成活率（移栽成活的组培苗数/移栽组培苗数×100%）。

1.3 培养条件

培养温度（25±1）℃，光照时间14 h/d，光照强度为30 μmol/（m2·s）。

1.4 数据分析

所得数据用DPS 7.05软件进行统计分析，多重比较采用Duncan新复极差法。

2 结果与分析

2.1 不同取材时间及茎尖大小对茎尖初代培养的影响

不同取材时间及茎尖大小对三倍体枇杷茎尖初代培养的影响见表1。从表1可以看出，冬季取材，成活率最低，为11.7%～28.9%；春季取材成活率最高，达58.9%～77.5%，为适宜的取材时间。春季取材时，当茎尖为0.4 cm时，茎尖成活率为58.9%，污染率为10.2%，均为最低；而褐化率却最高，为35.6%。当茎尖为1.0 cm时，褐化率为同取材时期最低，仅为12.1%，但污染率较高，为20.2%。当茎尖大小为0.7 cm时，既能控制较低水平的污染率（11.1%）和褐化率（12.2%），又能保证较高的成活率（77.5%），为适宜的三倍体枇杷茎尖大小。

2.2 6-BA、NAA和IBA不同浓度配比对枇杷茎尖初代培养的影响

6-BA、NAA及IBA的不同浓度组合对三倍体枇杷茎尖初代培养具有明显的影响（表2），当6-BA选用1.0 mg/L、NAA选用0.1 mg/L、IBA选用0.5 mg/L时，茎尖萌发率最低，仅为35.2%，极显著地低于其他处理，芽苗高度为1.5 cm，纤细，长势弱；当6-BA选用1.0 mg/L、NAA选用0.5 mg/L、IBA选用1.5 mg/L时，茎尖萌发率为91%，平均芽苗高度达2 cm，且长势好（图版Ⅰ-B）。综上所述，适合三倍体枇杷茎尖的初代培养基为：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.5 mg/L。

2.3 6-BA、NAA和GA3对三倍体枇杷芽苗伸长的影响

6-BA、NAA和GA3对三倍体枇杷芽苗伸长的影响见表3。从表3可看出，6-BA对枇杷茎尖伸长的影响很大，较低浓度的6-BA（0.5 mg/L）与不同浓度的NAA和IBA组合，茎尖芽苗高度普遍较高，在3.8～4.9 cm之间，其次是较高浓度的6-BA（1.5 mg/L）与不同浓度的NAA和IBA组合，芽苗高度普遍在3.5～4.0 cm之间，而6-BA选用中浓度1.0 mg/L时，芽苗高度普遍较低，在2.3～3.3 cm之间；当6-BA浓度一定时，芽苗高度随着NAA、GA3浓度的增加而升高，当6-BA选用0.5 mg/L、NAA选用0.3 mg/L、GA3选用0.3 mg/L时，芽苗高度达到最大值，为4.9 cm，且芽苗叶颜色深绿，长势良好（图版Ⅰ-C）。可见，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 0.3 mg/L为三倍体枇杷体茎尖伸长培养的适宜培养基配方。

2.4 6-BA、NAA和Tryptone对三倍体枇杷芽苗增殖的影响

6-BA、NAA与Tryptone不同浓度配比对芽苗增殖的影响见表4。经7～10 d培养，芽苗的大部分腋芽开始萌动，培养30 d左右时已形成丛芽。6-BA浓度为1.0 mg/L，NAA浓度为0.3 mg/L，Tryptone浓度为750 mg/L的芽苗增殖系数最高，为7.7，极显著高于其它处理，且芽苗长势较好（图版Ⅰ-D），其次为6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L与Tryptone 250 mg/L时，增殖系数为2.7，当6-BA浓度为0.5 mg/L、NAA浓度为0.5 mg/L、Tryptone浓度为750 mg/L时，增殖系数最低，仅为1.2，且芽苗基部愈伤化严重，长势较弱。结合增殖系数及芽苗长势，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+Tryptone 750 mg/L为芽苗增殖的适合培养基配方。

2.5 基本培养基和植物生长调节剂对三倍体枇杷芽苗生根的影响

基本培养基和植物生长调节剂对三倍体枇杷芽苗生根的影响见表5。从表5可以看出，基本培养基对三倍体枇杷芽苗生根差异明显：以MS为基本培养基，未能生根，而以1/2MS、1/4MS为基本培养基均有不定根的发生，其中又以1/2MS为基本培养基的生根效果最好。植物生长调节剂对三倍体枇杷芽苗生根也有显著的影响，培养基中仅添加IBA时，三倍体枇杷芽苗生根率较低，培养基中同时添加NAA和IBA时，芽苗生根率较高。当以1/2MS为基本培养基，同时添加NAA 0.25 mg/L、IBA 2.0 mg/L时，芽苗生根率最高，达73.3%，平均根数为5.1，平均根长为4.2 cm，生根苗长势健壮（图版Ⅰ-E）。由此可见，1/2MS+NAA 0.25 mg/L+IBA 2.0 mg/L为三倍体枇杷茎尖培养适宜的生根培养基。

2.6 炼苗和移栽

经炼苗移栽后的生根小植株，在不同的移栽基质里植株成活率和植株长势差异较大。移栽基质配比为腐叶土 ∶ 珍珠岩=3 ∶ 1时，组培苗移栽成活率为57.27%，植株叶片小，茎杆细，长势弱；移栽基质配比为腐熟有机肥 ∶ 园土 ∶ 锯末=1 ∶ 2 ∶ 1时，组培苗移栽成活率达93.67%，植株叶片大，茎杆粗壮，叶色深绿，长势健壮（图版Ⅰ-F）。由此可见，腐熟有机肥 ∶ 园土 ∶ 锯末=1 ∶ 2 ∶ 1为三倍体枇杷生根组培苗移栽的适宜基质。

3 讨论与结论

成年枇杷植株的叶片培养极其困难，外植体褐化严重、愈伤组织分化率低，难以满足遗传转化的需要，建立新的遗传转化受体系统非常必要。以茎尖作为外植体不需经过愈伤组织诱导及再分化成苗阶段，实验周期短，是遗传转化的良好受体材料，以此为受体的遗传转化在多种作物上得到了广泛的应用，包括大豆[7]、玉米[8]、棉花[9]、向日葵[10]、葡萄[13]等。

影响茎尖萌发及生长的调节物质有BA、NAA、GA3、TDZ等，在已报道的蔷薇科植物茎尖培养初代物建立选用最多的是BA和NAA[14-15]。而本研究结果表明：在三倍体枇杷茎尖培养萌发阶段起着关键作用是IBA，在设定的浓度范围内，三倍体枇杷茎尖的萌发率随着IBA浓度的增加而增加，这与前人的结果不一致，这表明三倍体枇杷在茎尖初代培养中对生长调节物质的需求与二倍体枇杷是很不一样的。在芽苗的伸长阶段，GA3起着关键作用，这与陈君帜等[16]的研究结果一致。

蔷薇科果树的茎尖培养中，很多研究结果均表明存在着生根难的问题，降低无机盐质量浓度配合一定浓度的生长素常常能解决生根难的问题[17]。例如，樱桃在全量的MS培养基上不能生根，而在1/2MS培养基上可形成根或根原基，且在含有IBA的培养基上生根最好[18]；南果梨在MS培养基上只有极低的生根率，而在1/2MS+IBA生根率最高[19]；桃、杏茎尖芽苗在1/2F14+IBA或1/2MS+IBA生根率可达85%以上[17]。本研究也得到类似结果，在MS培养基上，三倍体枇杷芽苗不能生根，而低无机盐浓度的基本培养基（1/2MS、1/4MS）配合生长素IBA和NAA则能生根，最高的可达73.3%。

本研究以三倍体枇杷茎尖为材料，首次成功再生出完整植株，建立了三倍体枇杷茎尖植株再生的基本技术体系，为利用转基因技术对三倍体枇杷进行遗传改良奠定了一定的基础。

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