猪链球菌2型毒力因子玤apdh基因的克隆?表达及与Hela细胞互作蛋白的筛选

袁芳艳等

摘要[目的]克隆并在大肠杆菌中表达猪链球菌2型毒力因子gapdh基因，寻找与GAPDH互作的受体蛋白。 [方法]扩增猪链球菌2型甘油醛3磷酸脱氢酶gapdh基因并构建表达质粒pET28agapdh。[结果]在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达了约41 kDa的融合蛋白GAPDH。Western blot试验说明GAPDH具有良好的免疫学活性。利用新西兰大白兔制备抗GAPDH蛋白的多克隆抗体。运用配体重叠技术，在 HeLa细胞中初步找到了一个与GAPDH蛋白作用的潜在受体蛋白。[结论]为进一步研究猪链球菌2型的分子致病机理奠定基础。

关键词2型猪链球菌；GAPDH；原核表达；多抗制备；受体

中图分类号S852.6文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12821-04

Abstract[Objective] The aim was to study cloning，expression of streptococcus suis type 2 virulence factors gapdh gene and screening for protein with Hela cell. [Method]The glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase gapdh gene of Streptococcus suis serotype 2 （S.suis 2， SS2） was amplified by PCR， and inserted into the expression plasmid pET28a. [Result] About 41 kDa fusion protein was successfully expressed in escherichia coli BL21（DE3）. Good immunological activity of GAPDH protein was confirmed by western blot test.The polyclonal antibodies of rabbit anti GAPDH protein was preparated.Using ligand overlapping technology， a possible GAPDH protein receptor proteins was preliminaryly found in HeLa .[Conclusion] The study laid a foundation for further insights into the molecular pathogenesis of SS2.

Key wordsStreptococcus suis serotype 2； GAPDH； Prokaryotic expression； Receptor

豬链球菌病是一种由猪链球菌（Streptococcus suis）引起的猪呼吸道疫病，世界各地均有发生，也是影响我国养猪业健康发展的重要传染病之一。2型猪链球菌病可引起猪脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎和败血症等，还可感染人发病并致死，是一种危险的人畜共患病[1-2]。目前已证实在美、法、日、俄、印度、丹麦、荷兰、加拿大等20多个国家和地区有该菌的存在[3]。在国内最早由吴硕显（1949）于上海郊区发现该病的散发病例，20世纪70年代发病增加，80年代后期发病更趋严重，在许多地方呈暴发流行。1998年7月中下旬，江苏省局部再次暴发猪急性败血型链球菌2 型传染病，并造成人死亡[4-5]。随后，在华南、西南、华东等地区有分离到该型菌的报道。2005年，四川省资阳地区暴发猪2型猪链球菌病，引起了人畜的死亡[6]。2型猪链球菌病不仅已成为我国养猪业发展的潜在威胁，而且还是一种广受关注的人畜共患病。

2型猪链球菌甘油醛3磷酸脱氢酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase，GAPDH）是一种糖酵分解反应酶，能将磷酸甘油醛（GAP）磷酸化，并产生1，3二磷酸甘油酯（DPG），主要存在于细菌胞浆中。关于哺乳动物GAPDH蛋白各种生物性能的鉴定已有较多报道[7]，包括运输和膜融合中的作用、微管组装、核输出和蛋白磷酸转移酶/激酶反应。同时也发现真核生物GAPDH与细胞附着有关，可能起到增强细胞骨架结构的作用[8]。GAPDH的功能多样性也存在于细菌中，特别在一些致病链球菌中。Madureira等[8]和Oliveira等[9]研究表明，在S.pyogenes、S.pneumoniae等的表面发现了GAPDH 蛋白。并用电子显微镜观察发现，链球菌表面确实存在GAPDH。通过gapdh的蛋白同源性证实，这些病原体包含一种高度保守的GAPDH蛋白，且与许多表面特异活动有关，这些活动包括作为细胞支架蛋白，进行细菌与宿主细胞之间的信号转导[10]。

目前，对链球菌早期阶段感染机制和细菌结构方面的研究较少。细菌表面的多功能GAPDH蛋白可能与细菌毒力相关。但GAPDH表面定位机制尚不清楚。因此，寻找与GAPDH互作的受体蛋白对于揭示2型猪链球菌致病性具有重要意义。HeLa细胞是2型猪链球菌感染的模型细胞之一，能够很好地用来研究链球菌感染过程中蛋白与蛋白之间的互作。笔者克隆并在大肠杆菌中表达了猪链球菌2型gapdh基因，制备了兔抗多克隆抗体，应用配体重叠技术，在HeLa细胞中初步找到一个与GAPDH互作的蛋白，这为进一步研究GAPDH在猪链球菌2型致病过程中的黏附机制奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种、质粒和细胞。

猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2，SS2）由动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室分离鉴定并保存。大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）菌株、HeLa细胞由动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室保存。克隆载体pMD18T、表达载体pET28a购自大连宝生物公司。

1.1.2试验动物。

新西兰大白兔购自湖北省预防医学科学院实验动物中心。

1.1.3主要药品及试剂。

LA Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶（400 u/ml），限制性内切酶BamHI、SalI均购自大连宝生物公司。蛋白酶K、卡那霉素、氨苄青霉素购自Sigma公司。LB、TSA和TSB培养基购自Difco公司。可溶性蛋白6×HisGAPDH纯化试剂盒购自Novagen公司。DNA回收试剂盒购自上海生工生物工程公司。新生牛血清（NCS）购自杭州四季青有限公司。辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗猪IgG、羊抗兔IgG购自SBA公司。

1.1.4抗生素。

氨苄青霉素：用灭菌蒸馏水配制成储存浓度50 mg/ml，-20 ℃保存备用；

卡那霉素：用灭菌蒸馏水配制成储存浓度25 mg/ml，-20 ℃备用。

1.1.5细菌基因组DNA提取试剂。

TE：10 mmol/L TrisHCl（pH 8.5），1 mmol/L EDTA，50 mg/ml的溶菌酶，2 mol/L NaCl，10% SDS，20 mg/ml的蛋白酶K，酚∶氯仿∶异戊醇（100∶99∶1），异丙醇，75%乙醇。

1.1.6大肠杆菌感受态细胞制备试剂。

TB：10 mmol/L Pipes，55 mmol/L MnCl2，15 mmol/L CaCl2，250 mmol/L KCl。除MnCl2外的其他成分先混合溶解，用KOH调pH至6.7，再加入MnCl2溶解，过滤除菌，4 ℃保存备用。

1.2方法

1.2.1链球菌基因组DNA提取。

接种链球菌于5 ml TSB液体培养基中，37 ℃摇床（220 r/min）培养过夜，取1 ml培养物于1.5 ml 离心管中，室温8 000 r/min 离心5 min，弃上清，0.5 ml TE洗滌2次，沉淀重新悬浮于1 ml TE中。然后加入6 μl 150 mg/ml的溶菌酶，37 ℃作用2 h。再加2 mol/L NaCl 50 μl，10% SDS 110 μl，20 mg/ml的蛋白酶K 3 μl，50 ℃作用3 h或37 ℃过夜。均分到2个1.5 ml离心管，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提2次，用0.6倍体积的异丙醇沉淀，再用75%乙醇洗涤，自然干燥后，溶于500 μl ddH2O中备用。

1.2.2PCR扩增gapdh基因。

1.2.2.1 引物。

参考GenBank中gapdh 基因序列，通过DNA star 软件分析，显示该片段有抗原结合位点，利用DNAman 软件自行设计引物，分别添加酶切位点BamHI和SalI及保护性碱基。引物由大连宝生物工程有限公司合成。

上游引物（P1）：GCCGGATCCATGGTAGTTAAAGTTG；

下游引物（P2）：GCCGTCGACTTATTTAGCAATTTTTG。

1.2.2.2PCR反应。

95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35个循环后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.2.3GAPDH多克隆抗体的制备。

大量提取纯化的融合蛋白，用Eppendor公司的Biospectrometer仪测定提纯蛋白浓度。如蛋白浓度太低，可将蛋白溶液装入透析袋中，用蔗糖进行浓缩。配得浓度为0.5～1.0 mg/ml。

将纯化的GAPDH蛋白与等体积完全弗氏佐剂混匀并乳化完全，在家兔后颈部分多点皮下注射，免疫剂量为1.0 mg/只。14 d后，将纯化的蛋白与等体积不完全弗氏佐剂混匀并乳化完全，并进行加强免疫。以后，每14 d加强免疫一次，共免疫4次。从第2次免疫开始，每次免疫前，采血分离血清，检测抗体效价，直至抗体水平达到试验要求。心脏采血，分离血清，置于-70 ℃保存备用。

1.2.4细胞总蛋白提取。

收集培养的HeLa细胞，向其中加入NP40缓冲液后冰浴30 min。超声波破碎，30 s/次，10次。沸水煮5 min，冰浴5 min。10 000 r/min离心10 min。取上清并用1.5 ml EP管分装，置于-20 ℃保存备用。

1.2.5细胞受体蛋白的初步寻找。

将所提取的HeLa细胞蛋白进行SDSPAGE电泳。电泳结束后，将凝胶电转硝酸纤维素膜。设置阴性对照试验。电转后封闭。试验组封闭后与含有GAPDH的 Reaction Buffer封闭过夜，阴性对照不与之封闭。其后过程同Western blot，所用一抗为“1.2.3”制备的GAPDH多克隆抗体，二抗为1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG。

2结果与分析

2.1gapdh基因的PCR扩增

PCR反应后，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果（图1），出现一条约为1 011 bp的条带。扩增结果与预期大小一致。

3讨论

3.1gapdh基因克隆与表达

该研究对gapdh全基因进行表达，将gapdh克隆到pET28a表达载体中。将重组质粒pET28a转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，经IPTG诱导后，表达了约41 kD的融合蛋白，与预期大小相符。对最佳诱导时间和最佳IPTG浓度进行摸索后，表明重组细菌在诱导3 h，IPTG终浓度为1 mmol/L时，融合蛋白的表达量最高。进一步Western blot试验表明，融合蛋白能与链球菌2 型阳性血清反应，具有免疫学活性。

IPTG（异丙基硫代βD半乳糖苷）是β半乳糖苷酶活性的诱导物，它通过与乳糖操纵元的阻遏蛋白相结合，使得乳阻遏蛋白的空间构像发生变化，导致四聚体解聚成单体，从而失去与操纵子特异性紧密结合的能力，最终解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。因IPTG对各种载体的诱导活性有差异，因此，选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。融合表达时在选择外源DNA同載体连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。

3.2pETgapdh融合蛋白的纯化

对重组细菌通过超声波进行裂解，并将裂解液上清和沉淀分别进行SDSPAGE。结果表明，融合蛋白在上清和沉淀中均有存在，但主要位表达在裂解液上清中，这说明重组表达细菌在37 ℃条件下诱导时，主要以可溶性蛋白的形式表达于上清中。这对该蛋白的进一步纯化非常有利。为了制备GAPDH多克隆抗体，该研究对融合蛋白用试剂盒进行了纯化。纯化效果较理想，得到的条带大小与目的蛋白一致。纯化所需的缓冲液要新鲜配制，过柱时最好让一种缓冲液流尽后再加另一种，以让液体与柱中的凝胶颗粒有充分地接触和反应时间。由于融合蛋白存在于上清中，故需先对细菌裂解液进行处理，得到上清滤出物。将上清滤出物过柱以纯化融合蛋白。Change Buffer中含有镍离子，可以吸附于柱中凝胶颗粒上，同时也可与6×His GAPDH 结合。上清中的GAPDH便吸附到凝胶颗粒上，再用Elution Buffer从凝胶颗粒上洗脱下来。

3.3关于细胞受体

该研究采用配体重叠技术（ligandoverlay approach）寻找GAPDH在HeLa细胞中的受体。以HeLa细胞为模型，提取HeLa细胞总蛋白进行SDSPAGE。通过毛细渗透和电场作用，使聚丙烯酰胺凝胶上的HeLa细胞总蛋白充分转移到硝酸纤维素膜，在一抗与靶蛋白作用之前，试验组硝酸纤维素膜与含有GAPDH蛋白的Reaction Buffer封闭过夜，而阴性对照不与之封闭。显色后，将试验组与阴性对照进行比较，当试验组出现条带而对照组中没有出现条带时，且经3次或3次以上具有很好的重现性，可初步认定该条带可能为所要寻找的受体蛋白。

该研究经过多次试验，已经找到了一条符合上述要求的条带。但这只是研究过程中的一个初步发现。因为SDSPAGE和Western blot试验结果受很多因素影响，除以上差别外，还有一些主观和客观上的差别。在无法消除这些差异的情况下，比较可取的措施是在不同条件下进行大量重复。如果重复后，绝大多数试验组在相同的位置出现同一条带，而对照组在该位置没有出现带，则可以初步判定该条带可能为寻找的受体蛋白。如要进一步研究确证该蛋白就是GAPDH受体蛋白，必须将该蛋白进行质谱测序，并通过酵母双杂交、免疫共沉淀等方法加以验证。

参考文献

[1] 马清霞，何孔旺，陆承平.猪链球菌病双重PCR诊断方法的建立[J].中国兽医科学，2007，37（8）：700-704.

[2] 李文平.人感染猪链球菌2型的研究进[J].中国兽药杂志，2005，39（8）：41-44，57.

[3] 张文东，张应国，宋建领，等.猪链球菌PCR检测技术研究进展[J].动物医学进展，2006，27（6）：10-14.

[4] 张炜.猪链球菌2型免疫蛋白组学和比较蛋白组学研究[D].南京：南京农业大学，2007.

[5] 张安定.猪2型链球菌免疫蛋白质组学与比较蛋白质组学的研究[D].武汉：华中农业大学，2008.

[6] 吴涛.链球菌2型revs基因缺失株构建及HYL蛋白与宿主互作的研究[D].武汉：华中农业大学，2008.

[7] SHEOKAND N，MALHOTRA H，KUMAR S，et al.Moonlighting cell surface GAPDH recruits Apo transferrin to effect iron egress from mammalian cells[J].J Cell Sci，2014 Jul 29 [Epub ahead of print]：

[8] MADUREIRA P，BAPTISTA M，VIEIRA M，et al.Streptococcus agalactiae GAPDH is a virulenceassociated immunomodulatory protein[J].J Immunol，2007，178（3）：1379-1387.

[9] OLIVEIRA L，MADUREIRA P，ANDRADE E B，et al.Group B streptococcus GAPDH is released upon cell lysis，associates with bacterial surface，and induces apoptosis in murine macrophages[J].PLoS One，2012，7（1）：29963.

[10] BRASSARD J，GOTTSCHALK M，QUESSY S.Cloning and purification of the Streptococcus suis serotype 2 glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase and its involvement as an adhesion[J].Vet Microbiol，2004，102（1/2）：87-94.