稻瘟病菌MoYpt5蛋白互作网络预测

党谢等

摘 要 稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）共有11个假定的Rab蛋白家族成员，本文选取了MoYpt51（MGG_06241）和MoYpt52（MGG_01185）进行了生物信息学分析。通过搜索多个大型蛋白互作数据库和文献，共得到数百个与核心蛋白互作的蛋白和互作对。利用信息处理技术和高效制图平台将这些蛋白互作对构建成互作网络，得到若干个具有生物学意义的模块。结果表明，筛选得到的互作蛋白中，有的参与了蛋白降解的泛素途径（MGG_04053等）、囊泡介导的蛋白胞内运输（MGG_01238等），有的在蛋白、染色体的组装和修饰等过程（MGG_03677等）起重要作用。大部分假定互作蛋白定位于细胞质和质膜上，为其与目标蛋白互作提供了空间可能性。

关键词 稻瘟病菌；MoYpt5蛋白；蛋白互作网络

中图分类号 Q71；Q291 文献标识码 A

The Prediction of Protein-protein Interaction Network

of MoYpt5 in Magnaporthe oryzae

DANG Xie， CHEN Jian*， LIAN Bi， WANG Zonghua， ZHOU Jie**

School of Life Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract There are 11 putative members of Rab family in Magnaporthe oryzae. MoYpt51（MGG_06241）and MoYpt52（MGG_01185）were chosen to conduct analysis of their protein interaction network by bioinformatics. We acquired hundreds of proteins and interaction-partners which interact with the core protein by searching several large protein interaction databases and references， and got a few significantly biological modules on the base of the technology of bioinformatics analysis and the platform of highly effective charting. The results showed that some（MGG_04053， etc.）of the screened proteins involve in the ubiquitin pathway of protein degradation and the protein transportation processes introduced by vesicles in cells（MGG_01238， etc.）， some（MGG_03677， etc.）play a crucial role in the assembling and modifying processes of proteins and chromosomes. Most of the interaction proteins are localized in the cytoplasm and on the cell membrane which generate a spatial possibility of interacting with targeting proteins.

Key words Magnaporthe oryzae； MoYpt5 protein； Protein-protein interaction network

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.025

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是研究植物病原真菌致病机理的重要模式生物。随着水稻和稻瘟病菌基因组测序完成，人们将分子遗传学、功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学等方法相结合对水稻和稻瘟病菌之间的互作关系进行更加深入的探索，希望从分子生物学水平上开辟一条新的防治道路[1]。

在哺乳动物细胞中，Rab5蛋白至少存在着Rab5a、Rab5b和Rab5c 3种形式[2]，酿酒酵母中Rab5（Ypt5）有3个同源蛋白：Ypt51（Vps21）、Ypt52和Ypt53[3]。Rab5不仅参与细胞内的物质运输和蛋白分选，而且还参与信号转导与细胞骨架的构建[4-5]，在筛选小鼠巨噬细胞cDNA文库时，Rab5参与并增强了凋亡细胞被吞噬的过程[6]。Ypt5在胞吞作用过程中起着关键作用，能够调节膜泡的融合、囊泡的运输以及内涵体的形成[7-9]。此外，Ypt5还参与酵母的有性交配过程和细胞形态建成，其功能的异常会导致酵母对钙离子和钾离子更加敏感[10]。

和其他小G蛋白一样，Rab蛋白的功能主要是通过其上游的调节蛋白和下游的效应蛋白实现的，因此，寻找Rab蛋白的互作蛋白才能深入地了解Rab蛋白的生物学功能。本文利用酵母中Ypt51和Ypt52的氨基酸序列在稻瘟病菌数据库中进行同源搜索，得到同源性较高的MoYpt51（MGG_06241）和MoYpt52（MGG_01185），建立了稻瘟病菌MoYpt5的蛋白互作网络，为筛选病原菌中相互作用蛋白提供一种可借鉴的手段。

1 材料与方法

1.1 所用数据库和生物信息学软件

MPID（稻瘟病菌蛋白互作数据库[11]，Http：//bioinformatics.cau.edu.cn/cgi-binzzd-cgi/ppi/mpid.pl）；SGD（酿酒酵母基因组数据库，Http：//www.yeastgenome.org/）BioGRID（生物通用相互作用数据库集[12]），Http：//thebiogrid.org/）；IMEx（国际分子相互作用交换联盟，Http：//www.imexconsortium.org/）；Cytoscape软件。

1.2 生物信息学分析方法

1.2.1 进化分析 以稻瘟病菌MoYpt51（MGG_06241）和MoYpt52（MGG_01185）为靶蛋白在NCBI（Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和稻瘟病菌数据库（Http：//www.broadinst—itute.org/annotation/genome/magnaporthe_

comparative/MultiHome.html）中进行BLASTP搜索，E值设为1e-6，并通过保守结构域分析（Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi.）从而获得这些蛋白在动物、植物以及微生物中的同源蛋白序列。在获得稻瘟病菌Ypt5蛋白同源序列的基础上，使用ClutsalX1.83软件进行多重比对，形成序列多重比对结构图，结合MEGA4.0建立稻瘟病菌MoYpt51和MoYpt52与其他生物同源蛋白间的系统进化树。

1.2.2 蛋白互作网络的建立 利用Cytoscape软件及其插件得到预测网络的分割模块，再通过文献和代谢通路数据库对模块的生物学意义和功能进行深入分析，同时，对PPI进行拓扑结构分析，包括网络基本参数、度分布、最短通径、压力向心力和聚类系数等，从而评估数据的可信度和稳定性[13]。

1.2.3 互作蛋白的亚细胞定位分析 本实验使用的细胞内定位预测软件是CELLO（Subcellular localization predictive system），此软件适用于大部分的真核生物，对真菌的预测准确度比较高，主要是依据蛋白序列结构上的特异性，是多种算法和计算软件的集合。

1.2.4 结构域搜索和互作验证 利用Pfam（Protein families database）和iPfam（interaction Pfam）数据库进行分析。数据库[14]（Http：//pfam.sanger.ac.uk）是以序列多重比对和隐马尔可夫模型为基础蛋白家族和结构域的大型综合数据库；iPfam（interaction Pfam）数据库是Pfam数据库的蛋白互作子数据库，它描述在PDB中收录的已观测到的DDI（Domain-Domain Interaction）。以PDB中储存的多结构域蛋白和蛋白复合物为基础，计算结构上足够接近并能形成相互作用的残基之间的距离和识别原子间键之范德华力、氢键、盐桥和二硫键等的相互作用[15]。然后将先前预测得到的稻瘟病菌Ypt5蛋白互作对的序列信息输入Pfam数据库中进行蛋白结构域的查找和互作分析，从而进一步对蛋白互作网络进行验证。

2 结果与分析

2.1 MoYpt51和MoYpt52进化分析

以稻瘟病菌MoYpt51（MGG_06241）为靶蛋白在NCBI和稻瘟病菌数据库进行同源蛋白搜索和BLASTP比对分析，获得这些蛋白在动物、植物以及微生物中的同源蛋白序列17个（图1-A），并从中挑选6个具有典型意义的稻瘟病菌Ypt5蛋白同源序列，分别为：NcYpt51（XP_964811.1）、AkYpt51（GAA82723.1）、SpYpt51（NP_593907.1）、HsRab5（NP_002859.1）、RnRab5（NP_001099310.2）、ScYpt51（NP_012939.1）。使用Clustal X 1.83软件形成序列多重比对结构图（图1-B）。

用同样方法，共找到稻瘟病菌MoYpt52（MGG_01185）同源蛋白14个（图2-A），并从中挑选6个具有典型意义的稻瘟病菌Ypt52蛋白同源序列，分别为：NcYpt52（XP_955952.1）、AcYpt52（XP_001271078.1）、ScYpt52（NP_014732.1）、HsRab5a（NP_004153.2）、MmRab5a（NP_080163.1）、AtRab5a（NP_193699.1），进行了多重比对分析（图2-B）。

从以上2个蛋白的系统进化树可以看出，MoYpt51和MoYpt52与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisia）的遗传距离较近，同源性高。由于在真菌领域对粗糙脉孢菌研究相对来说不够深入，数据库的知识量偏少，所以在下面基于同源映射搜索蛋白互作对的过程中，主要选取酿酒酵母作为模式真菌。氨基酸序列比对表明MoYpt51和MoYpt52都具有G结构域和可变的N端和C端组成。G结构域中具有5个高度保守的氨基酸序列RabF1-F5，可作为Rab蛋白鉴定的特征序列，4个保守序列RabSF1-4可作为区分Rab蛋白亚家族的特征序列。这说明Rab家族蛋白的功能结构域是十分保守的，这为基于蛋白结构域上的互作验证准确性奠定了基础。

2.2 MoYpt51和MoYpt52的假定互作蛋白

从MPID数据库中共得到MoYpt51（MGG_06241）的假定互作蛋白8个，SGD数据库6个，BioGrid互作数据库27个，IMEX蛋白互作综合数据库3个（表1）。

从MPID数据库中共得到MoYpt52（MGG_01185）的假定互作蛋白共1个，SGD数据库5个，BioGrid互作数据库10个，IMEX蛋白互作综合数据库1个（表2）。

通过4个大型蛋白互作数据搜索，得到了上百个与核心蛋白互作的一级和二级互作蛋白（二级蛋白较多未列出），结合数个文献数据的支持，表明这些互作蛋白之间有某些化学或者是物理学之间的互作关系。

2.3 MoYpt51和MoYpt52的蛋白互作网络和亚细胞定位

进一步，本研究建立了MoYpt51（MGG_06241）蛋白互作网络图（图3-A），该网络共涉及到248个蛋白，652个互作蛋白对，其中与核心蛋白MoYpt51互作的一级蛋白共39个，其余为二级互作蛋白208个。

图3-B是从图3-A剥离出来的互作网络子图，此子图中只有核心蛋白和直接与核心蛋白互作的一级蛋白，并使用CELLO数据库对这些互作蛋白进行了亚细胞定位分析。MoYpt51蛋白主要定位在细胞质[16]，所以位于细胞质和质膜上的蛋白与其互作的概率较大，这样的蛋白共有19个，占一级互作蛋白总数的48.7%。

MoYpt52（MGG_01185）互作网络图（图4-A）共涉及到144个蛋白，352个互作蛋白对。其中与核心蛋白MoYpt52互作的蛋白共17个，其余为二级互作蛋白126个。

亚细胞定位预测结果表明，MoYpt52蛋白定位于细胞质（图4-B），这类蛋白共有10个，占一级互作蛋白总数的58.8%，MoYpt52蛋白互作网络里有50%以上的假定互作蛋白在亚细胞定位上与MoYpt52蛋白有空间上的互作关联。

2.4 MoYpt51和MoYpt52蛋白互作网络的模块聚类分析

对MoYpt51蛋白互作网络进行模块分割，共得到6个聚类模块（图5A-F），通过代谢通路和文献分析，模块A和B中的核心蛋白MGG_04053和MGG_07727以及关联蛋白MGG_00908、MGG_03512、MGG_07031和MGG_00170等都是蛋白泛素降解途径的重要蛋白；模块C中的核心蛋白MGG_01238以及关联蛋白MGG_05256和MGG_03283与囊泡介导的蛋白胞内运输有关；模块D中的核心蛋白MGG_06343和它的互作蛋白MGG_01652、MGG_00904和MGG_07931参与了胞内蛋白的折叠过程；模块E中的4个蛋白参与了蛋白磷酸化过程，该模块可能是胞内信号转导途径的部分；F模块含有内涵体向高尔基体逆向运输的调节蛋白MGG_08645，而MGG_04143也是转运相关蛋白，初步推测该模块是细胞内吞过程的下游代谢模块之一。

对MoYpt52蛋白互作网络进行分割共得到5个模块（图6A～E），模块A的核心蛋白MGG_02608以及相关蛋白MGG_00908、MGG_01380和MGG_

07031等众多蛋白都参与了蛋白泛素降解途径，这是从主网络中分离的较为完整的蛋白代谢模块；模块B中的核心蛋白MGG_01238以及关联蛋白MGG_

05256和MGG_03283与囊泡介导的蛋白胞内运输有关，推测其为蛋白胞内转运的代谢模块之一；模块C中的核心蛋白MGG_06910以及枢纽蛋白MGG_09346与胞内蛋白从内质网向高尔基体转运过程有关，这是一个胞内蛋白运输代谢模块之一；模块D中的关联蛋白MGG_04389和MGG_04978预测是内吞过程中蛋白锚定功能模块；模块E中核心蛋白MGG_03677具有乙酰转移酶活性，而其他几个关联蛋白与染色体的组装有关，该模块可能参与了染色体的组装和修饰。

2.5 结构域搜索和互作验证

将互作蛋白的序列数据输入到Pfam数据库中（Http：//pfam.sanger.ac.uk/）得到结构域信息和PfamIDs。在此基础上利用IPfam和3DID（Http：//3did.irbbarcelona.org/domainquery.html）等结构域互作数据库来验证这些蛋白的互作关系。结果表明（表3、4），MoYpt51结构域互作蛋白有7个，MoYpt52结构域互作蛋白有5个，所有这些用结构域互作筛选到的蛋白都在先前筛选的互作蛋白库内，这也就说明了研究数据的可信性。

3 讨论与结论

3.1 MoYpt51和MoYpt52蛋白互作网络特性分析

本文筛选的预测蛋白都是通过生物信息学同源映射方法而来，其数据量较大，具有广阔的筛选空间和一定的可信度。从网络的拓扑特性上看，这些互作网络与随机网络相比具有明显无尺度网络特征和小世界属性，蛋白间联系较为紧密，有一定的模块聚类特点。利用结构域数据库分析验证了部分具有较高互作可能性的蛋白，这些蛋白都有着若干个与Ras家族的特定保守结构域G1-G5以及Rab家族的特定基序RabF1-4相互作的特定功能结构域，进一步说明了这些蛋白和MoYpt5互作的可能性。

3.2 MoYpt51和MoYpt52蛋白互作网络的验证

酵母相关研究表明，CORVET复合物是酵母中Ypt5的效应子，而Vps8是CORVET的一个重要亚基[3，17]，主要参与囊泡的胞内运输过程，经酵母Vps8同源比对得到稻瘟病菌中的MGG_01238。Vps9是Ypt51（Vps21）的上游调节蛋白鸟苷酸交换因子GEF，对Vps21的活性起着至关重要的作用[19]，同源比对可以得到稻瘟病菌中的MGG_05379。鸟苷酸解离因子（GDI）负责将细胞之中GDP结合态的Rab蛋白运输到质膜上面，对Ypt51的功能循环起着重要的调节作用[20]，稻瘟病菌中的同源蛋白为MGG_07137。这些研究与本文的部分结果十分契合，进一步说明了本文预测的互作蛋白可信度。

3.3 MoYpt51和MoYpt52蛋白互作网络预测的意义

目前，Rab5/Ypt5多在酵母和人类中进行了相关的功能研究，但至今还未见到稻瘟病菌中对此类蛋白的报道。本文分别对稻瘟病菌MoYpt51和MoYpt52的蛋白互作网络进行了相关的预测，得到了大量的数据，包括与MoYpt5互作的蛋白和相关蛋白的亚细胞定位，这些结果和人类以及酵母的Rab5/Ypt5在胞吞、囊泡融合等功能上是相对应的，为研究MoYpt51和MoYpt52的功能关系、其下游效应子的鉴定以及MoYpt5的体内互作分子网络提供了可行性依据，为稻瘟病菌的致病机制以及稻瘟病的防治奠定了理论基础。

参考文献

[1] Liu J， Wang X， Mitchell T， et al. Recent progress and understanding of the molecular mechanisms of the rice-Magnaporthe oryzae interaction[J]. Mol Plant Pathol， 2010， 11（3）： 419-427.

[2] Chiariello M， Bruni C B， Bucci C. The small GTPases Rab5a， Rab5b and Rab5c are differentially phosphorylated in vitro[J]. Federation of European Biochemical Societies， 1999， 453： 20-24.

[3] Lachmann J， Barr F A， Ungermann C. The Msb3/Gyp3 GAP controls the activity of the Rab GTPases Vps21 and Ypt7 at endosomes and vacuoles[J]. Molecular Biology of the Cell， 2012， 23（13）： 2 516-2 526.

[4] Nielsen E， Severin F， Backer J M， et al. Rab5 regulates motility of early endosomes on microtubules[J]. Nature Cell Biology， 19991， 1： 376-382.

[5] Barbieri M A， Fernandez-Pol S， Hunker C， et al. Role of Rab5 in EGF receptor-mediated signal transduction[J]. Eur J Cell Biol， 2004， 83： 305-314.

[6] Nakaya M， Tanaka M， Okabe Y， et al. Opposite effects of rho family GTPases on engulfment of apoptotic cells by macrophages[J]. Jour of Bio Chem， 2006， 281（13）： 8 836-8 842.

[7] Horazdovsky B F， Buschl G R， Emr S D. VPS21 encodes a rab5-like GTPbinding protein that is required for the sorting ofyeast vacuolar proteins[J]. The EMBO Journal， 1994， 13（6）： 1 297-1 309.

[8] Gerrard S R， Bryant N J， Stevens T H. VPS21 controls entry of endocytosed and biosynthetic proteins into the yeast prevacuolar compartment[J]. Molecular Biology of the Cell， 2000， 11： 613-626.

[9] Armstrong J， Craighead M W， Watson R， et al. Schizosaccharomyces pombe ypt5： A homologue of the rab5 endosome fusion regulator[J]. Molecular Biology of the Cell， 1993， 4： 583-592.

[10] Tsukamoto Y， Katayama C， Shinohara M， et al. The small GTPase Rab5 homologue Ypt5 regulates cell morphology， sexual development， ion-stress response and vacuolar formation in fission yeast[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2013， 441： 867-872.

[11] He F， Zhang Y， Chen H， et al. The prediction of protein-protein interaction networks in rice blast fungus[J]. BMC Genomics， 2008， 9： 519.

[12] Stark C， Breitkreutz B J， Chatr-Aryamontri A， et al. The BioGRID interaction database： 2011 update[J]. Nucleic Acids Research， 2011， 39： 698-704.

[13] 欧阳玉梅， 方若森， 马志强. 评估蛋白相互作用可信度的生物信息学方法[J]. 生命科学， 2008， 20（3）： 408-414.

[14] Finn R D， Tate J， Mistry J， et al. The Pfam protein families database[J]. Nucleic Acid Res， 2008， 36： D281-288.

[15] 欧阳玉梅. 结构域相互作用数据库的产生、 发展与应用[J]. 生物化学与生物物理进展， 2009， 36（3）： 280-287.

[16] Dean R A， Talbot N J， Ebbole D J， et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea[J]. Nature， 2005， 434： 980-986.

[17] Epp N， Ungermann C. The N-terminal domains of Vps3 and Vps8 are critical for localization and function of the CORVET tethering complex on endosomes[J]. PLoS ONE， 2013， 8（6）： e67 307.

[18] Hama H， Tall G G， Horazdovsky B F. Vps9p Is a guanine nucleotide exchange factor involved in vesicle-mediated vacuolar protein transport[J]. The Journal of Biol Chem， 1999， 274（21）： 15 284-15 291.

[19] Nava S. Ypt and Rab GTPases： insight into functions through novel interactions[J]. Curr Opin in Cell Biol， 2001， 13（4）： 500-511.

责任编辑：叶庆亮