猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立

陈星瑶 张子群 王晓龙

摘 要：猪圆环病毒2型属于圆环病毒科圆环病毒属，是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。该病在世界范围内广泛流行，给我国养猪业造成一定的经济损失。目前针对PCV-2的检测技术还有提升的空间，因此本研究针对PCV-2 的Cap 基因高度保守的区域作为靶序列设计引物，建立了一种可快速、灵敏、特异地检测PCV-2 的LAMP 检测方法。

关键字：猪圆环病毒2型；环介导等温扩增技术（LAMP）

猪圆环病毒2型（PCV-2）属于圆环病毒科圆环病毒属，是20世纪末期被发现的单链负股DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称，无囊膜，直径大约17 nm。PCV-2是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原[1]。目前，该病在世界范围内的广泛流行已经给各国养猪业造成了巨大的经济损失[2]。国内经过血清学和流行病学调查也证实了PCV-2感染非常严重[3-6]。2002年，由PCV-2感染引起的PMWS在全国各地爆发式流行，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[3]。PMWS已成为我国规模化猪场危害养猪生产的重要免疫抑制性疫病之一[7]。当下建立一种便捷、快速、特异的PCV-2检测方法，以确保及时发现并采取有效措施控制PMSW的发生就显得非常重要。

环介导恒温扩增技术（1oop-mediated isothermal amplification， LAMP）是2000 年由日本的Notomi 等人发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法[8]。由于LAMP具有反应条件非常简单、结果读判方便，加之其敏感、特异、快速的优点，已被用于多种病原的检测诊断[9， 10]。本研究针对PCV-2 的Cap 基因高度保守的区域作为靶序列设计引物，旨在建立一种可快速、灵敏、特异地检测PCV-2 的LAMP 检测方法.。

1材料和方法

1.1病毒来源

猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病毒基因组以及猪瘟病毒cDNA、猪流感cDNA、口蹄疫cDNA、猪蓝耳病cDNA由本实验室分离并保存。

1.2主要试剂及仪器

Marker（DL2000，DL100）购自大连TaKaRa公司，dATP，dTTP，dCTP，dGTP均购买自大连宝生物公司。Bst DNA聚合酶，琼脂糖，甜菜碱，镁离子购自NEB公司；其他常规试剂均为国产分析纯。

1.3引物设计及制备

应用网上Lamp引物设计软件（PrimerExplorerV3）对Cap基因设计引物（图1），从获得的数百对引物中选择评分较高的引物，送南京金斯瑞生物工程有限公司进行5'端修饰合成。

1.4 猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立

猪圆环病毒2型阳性样本测序后测定浓度，分装备用。

配制LAMP（2×）的反应缓冲液： 1M Tris-HCl （pH8.8） 贮存液 40 mL，KCl 1.49 g ，MgSO4 1.93 g，（NH4）2SO4 2.64 g，Tween-20 2 mL，Betaine 187.4g，将上述药品混合后加入ddH2O定容至900 mL，混匀后取900 μL，再加入100 μL的 25 mM dNTP混合液（dATP 25 μL、dCTP 25μL、dGTP 25μL、dTTP 25μL）。

配制LAMP引物混合物（100uM Primer stock）包括：FIP 20 μL，BIP 20 μL，F3 2.5 μL和B3 2.5 μL。

25 μLLAMP的反应体系：Bst DNA 聚合酶1 μL，猪圆环病毒2型DNA 2 μL，ddH2O 8.6 μL，2倍的反应缓冲液12.5 μL，引物混合物0.9 μL。

1.5 LAMP反应条件优化

反应温度优化：根据反应体系优化策略，设置4组实验，分别为60℃，62℃，64℃及66℃，按1.4反应体系进行实验，反应时间为1 h，结束后各取2 μL样品在2%琼脂糖凝胶中进行分析。

反应时间优化：分别设置3个实验组，时间分别为30 min，45 min和60 min，按1.4反应体系进行实验，反应在62℃下进行，结束后各取2 μL样品在2%琼脂糖凝胶中分析。

1.6 LAMP灵敏度检测实验

将前述提取的猪圆环病毒2型DNA进行浓度测定，依次倍比稀释成107～10-2个拷贝，按照上述1.4反应条件检测猪圆环病毒2型LAMP引物的灵敏性。

1.7 LAMP特异性检测实验

以猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪蓝耳病病毒和水，制备DNA或cDNA作为模板，按照建立的方法进行LAMP扩增，检测猪圆环病毒2型LAMP的特异性。

1.8染料可视化试验

为进一步优化LAMP的反应条件，在LAMP反应结束后，加入2 μLSYBR Green Ⅰ荧光染料观察阴性和阳性反应颜色的变化情况。

2 实验结果与分析

2.1 LAMP反应条件优化

2.1.1温度优化

猪圆环病毒2型LAMP引物温度优化中，扩增60 min后电泳检测结果如图2所示，其中60℃，62℃和64℃有扩增条带产生，66℃无条带产生，阴性对照无条带产生，因此LAMP引物扩增温度可选择60℃，62℃，64℃中任一温度。

2.1.2时间优化

猪圆环病毒2型LAMP引物扩增在60℃下扩增不同时间的后核酸电泳检测结果（见图3）。其中扩增45 min、60 min后均有扩增条带产生，30 min无条带产生，因此可选择LAMP反应 60℃下的扩增时间为45 min。

2.2 LAMP灵敏度检测实验

猪圆环病毒2型LAMP引物扩增不同浓度梯度基因后核酸电泳检测结果，扩增条件为60℃，扩增时间为45 min。如图所示：107～101个拷贝的模板均有特异性产物产生，其余无条带产生，图4可看出本研究所设计的LAMP引物在60℃下，扩增45 min之后最少可检出10个拷贝的模板。

2.3LAMP特异性检测实验

以猪圆环病毒2型基因组为模板，使用LAMP引物在60℃下扩增45 min后核酸电泳检测结果。由图5可见，猪圆环病毒2型LAMP引物特异性扩增出了猪圆环病毒2型基因片段，而与其他病原并无交叉反应。

2.4染料可视化试验

向LAMP引物扩增不同浓度梯度基因的反应产物管内加2 μl SYBR GreenⅠ荧光染料，肉眼观察，阳性反应管颜色立刻变为黄绿色，且模板浓度不同颜色有深浅变化（图6）。由此可见，LAMP 反应结果容易判定，临床推广。

3讨论

猪圆环病毒根据基因型和致病性可分为PCV-1和PCV-2两种类型，PCV1没有致病性。系统发生分析结果表明，PCV-1和PCV-2属于不同基因群，但其基因组仍存在较高的同源性[11]，与病毒复制相关的DNA复制起始区（Ori）和复制酶编码基因（Rep）序列同源性分别为79.5%和82%，衣壳蛋白编码基因（Cap）存在较大差异，同源性仅为62%[12]。

建立PCV-2的LAMP检测方法，引物的设计是关键。PCV-2含有11个阅读框，其中第一个和第二个为主要的阅读框，各实验室目前基因疫苗的研制主要围绕这两段基因序列。第一个阅读框编码与复制相关的酶，第二个阅读框PCV-2 Cap基因编码该病毒衣壳蛋白，基因N端123个碱基为信号肽编码序列，编码的衣壳蛋白上有病毒的主要保护性抗原位点，具有免疫原性，能引起机体产生抗体，故选取该基因进行引物设计。

LAMP技术可以保证扩增的高特异性和高效率，其依赖于能够识别靶DNA 上6个特定区域的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下扩增核酸，能从仅相差一个核苷酸的基因标本中找出相应靶序列进行扩增，根据扩增与否即可判断目的基因是否存在。

综合文中的试验结果，LAMP 检测技术为猪圆环病毒2型基因的诊断提供了一种快速、便捷且特异性强、敏感性高的检测方法，可用于猪圆环病毒2型临床检测，并具有非常良好的应用前景。■（编辑：何芳）

参考文献：

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