动物组织中氟苯尼考残留的半定量快速检测胶体金试纸条的研制

孙素玲 徐园芳

摘要[目的]为动物组织中氟苯尼考残留快速检测试纸条的制备奠定基础。[方法]采用琥珀酸酐法制备氟苯尼考人工半抗原，用活泼酯法将氟苯尼考人工半抗原与牛血清蛋白进行偶联制备氟苯尼考人工抗原。紫外光谱法和光谱分析法对氟苯尼考人工抗原FFCHSBSA进行鉴定。[结果]与BSA和FFC相比， FFCHSBSA的最大吸收峰发生了变化，曲线形状也发生了改变，FFC-HS与BSA的偶联比为18.9∶1。[结论]FFC-HS-BSA人工抗原的合成是成功的，其偶联比在最适范围内。

关键词氟苯尼考；人工抗原；琥珀酸酐法；活泼酯法；偶联比

中图分类号S859.84文献标识码A文章编号0517-6611（2014）23-07757-02

基金项目安徽科技学院自然科学研究项目（ZRC201425）。

作者简介 孙素玲（1958-），女，安徽砀山人，教授，从事兽药残留检测的研究。

收稿日期20140627氟苯尼考是酰胺醇类第3代动物专用抗菌药，具有广谱、高效、吸收好、体内分布广、无致再生障碍性贫血作用等特点，作为氯霉素的替代药物被广泛用于治疗畜禽的细菌性疾病[1]，还用作猪的饲料添加剂来预防和治疗猪的细菌性疾病[2]。研究表明，氟苯尼考具有胚胎毒性和耐药性，在畜禽生产上的大量应用也导致其在畜禽产品中残留，危害公众健康。欧盟、日本等国均制定了动物食品中氟苯尼考的最大残留量标准，我国农业部235号公告也对其残留限量做出了严格规定。

目前，检测动物性食品中氟苯尼考残留的检测方法主要是色谱分析法[3-4]和免疫分析方法（如酶联免疫吸附试验（ELISA）和ELISA试剂盒等）[5]。色谱分析法具有准确、敏感的优点，但也具有检测需要时间长、样品前处理比较复杂、操作烦琐、需要特殊的仪器、成本高等缺点。免疫分析法具有简便、灵敏度高、特异性好等优点。动物组织中氟苯尼考残留的半定量快速检测胶体金试纸条制备是属于免疫分析方法，建立氟苯尼考残留免疫分析方法最关键的一步是氟苯尼考人工抗原的合成。笔者对氟苯尼考人工抗原进行合成与鉴定，为氟苯尼考抗体的制备及动物组织中氟苯尼考残留快速检测试纸条的制备奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 主要试剂。氟苯尼考，纯度≥99.0%，购自武汉三洹医药化工有限公司；牛血清白蛋白（BSA），含量≥98%，购自上海源聚生物科技有限公司；琥珀酸酐，AR级，含量≥99%，购自陕西省渭南市惠丰化学工业有限责任公司；N，N二甲基甲酰胺（DMF），AR级，购自天津市大茂化学试剂厂；N羟基琥珀酰亚胺（NHS，含量≥99%），AR级，购自上海金穗生物科技有限公司。

1.1.2主要仪器。 YP600型电子天平，购自上海精密科学仪器有限公司； BCD502F型冰箱，购自青岛海尔冰箱股份有限公司；TLD802B型离心机，购自上海安亭科学仪器厂；752型紫外光分光光度計，购自南京麒麟分析仪器有限公司；JB1A搅拌器（雷磁），购自上海梦汉实业有限公司。

1.2方法

1.2.1氟苯尼考人工抗原的制备。

1.2.1.1氟苯尼考-半琥珀酸酯（FFCHS）的制备[6]。参照文献[6]方法，氟苯尼考（FFC） 6.0 g 、琥珀酸酐4.5 g搅拌溶于45 ml无水吡啶中， 60 ℃ 回流反应24 h，旋转蒸器中蒸去吡啶，用60 ml乙酸乙酯复溶蒸干物，转至250 ml分液漏斗中， 待溶液分层后，用0.5 mol/L HCl 40 ml洗涤3次，三蒸水40 ml洗涤3次，得到橙红色溶液。减压浓缩上述溶液， 避光真空干燥48 h后得到粉红色单酯粗品FFCHS。

1.2.1.2 FFCHS与BSA的偶联（活泼酯法）[7]。参照文献[7]的方法，用4 ml的N，N二甲基甲酰胺溶解500 mg的半抗原，再加入270 mg N羟基琥珀酰亚胺和460 mg N，N二环己基碳酰亚胺， 室温避光搅拌24 h。将反应液2 000 r/min 离心10 min， 弃去沉淀，上清液即为制备的氟苯尼考活化中间产物。将氟苯尼考活化中间产物在搅拌下逐滴加到含100 mg BSA的16 ml PBS中，搅拌1 h后转至4 ℃下搅拌48 h。4 ℃搅拌下，用pH7.4的0.01 mol/L PBS透析，每8 h换液1次，透析2 d。2 000 r/min离心10 min，取上清液得到FFCHSBSA人工抗原。小量分装，-20 ℃下保存。

1.2.2氟苯尼考人工抗原的鉴定。

1.2.2.1 FFCHSBSA溶液的蛋白浓度测定（双缩尿法）[8]。根据文献[8]的方法，将透析好的FFCHSBSA适当稀释后，测定在260和280 nm波长处的吸光度值，按照以下公式计算蛋白浓度：蛋白浓度（mg/ml）=1.45OD280 nm-0.74 OD260 nm。

1.2.2.2紫外光谱法鉴定FFCHSBSA人工抗原的合成。氟苯尼考在紫外区能产生明显的吸收光谱。用PBS将BSA、透析好的FFCHSBSA均配成100 μg/ml质量浓度，用甲醇溶解FFC配成100 μg/ml质量浓度。 FFC用甲醇作参比，其余均用稀释液PBS作参比，在200～400 nm紫外光区对FFCHSBSA溶液、BSA溶液和FFC溶液进行光谱扫描，通过数据和图谱的对比可证明偶联成功与否。

1.2.2.3 FFCHSBSA人工抗原结合比的测定（光谱分析法）[9]。根据上述用紫外分光光度计测定出的FFC的最大吸收波长，在FFC最大吸收波长下测定FFCHSBSA和BSA的吸光度值，按照以下公式计算FFCHSBSA人工抗原结合比：

结合比=∑偶联物-∑蛋白质∑半抗原

=（A偶联物-A蛋白质）×C半抗原×M蛋白质A半抗原×M半抗原×C蛋白质

式中，A为吸光度；M为相对分子质量；C为质量浓度/（mg/ml）。

2 结果与分析

2.1氟苯尼考人工抗原的鉴定

2.1.1 FFCHSBSA溶液的蛋白浓度。经双缩尿法测定的FFCHSBSA中蛋白质质量浓度为3.30 mg/ml。

2.1.2紫外光谱法鉴定FFCHSBSA人工抗原的合成。从可以看出，FFC在233 m波长处有最大吸收峰，BSA在214 nm波长处有最大吸收峰， FFCHSBSA在229 nm波长处有最大吸收峰。 FFCHSBSA与BSA和FFC相比，不但最大吸收峰发生了变化，曲线形状也发生了改变，表明FFCHSBSA人工抗原的合成是成功的。

FFC、BSA和FFCHSBSA的紫外掃描图谱2.1.3 FFCHSBSA人工抗原结合比。根据紫外扫描图，FFC的最大吸收波长为233.0 nm，在233.0 nm波长处测定的FFCHSBSA与BSA的吸光度分别为1.077和0.44，计算出的BSA与半抗原的结合比为18.9∶1 。

3讨论

人工抗原的合成在兽药残留的免疫分析方法中是最关键的环节，人工抗原的质量直接决定着抗体的效价和特异性[9]。FFC是半抗原，本身并不具备免疫原性，必须和载体蛋白偶联才能成为完全抗原。FFC分子结构中没有与载体蛋白连接的功能性基团氨基（-NH2）和羧基（-COOH），必须先将FFC分子结构进行改造成具有氨基或者羧基。笔者利用FFC分子结构上所带的羟基（-OH），用琥珀酸酐作 “间隔臂”，将其改造成具有羧基（-COOH）的活性半抗原FFCHS。为了防止载体蛋白之间的交叉反应，笔者选用BSA作为载体蛋白，用活泼酯法将FFCHS的羧基与载体蛋白BSA上的氨基相联，合成含CONH键的FFCHSBSA人工抗原。

FFC与载体蛋白的偶联效果如何将直接影响FFCHSBSA人工抗原的免疫效果，笔者利用紫外扫描法和FFCHS与载体蛋白之间的结合比测定对FCHSBSA偶联效果进行分析。紫外扫描法结果表明FFCHSBSA与BSA和FFC相比，不仅最大吸收峰发生了变化，而且曲线形状也发生了改变，表明人工抗原FFCHSBSA的合成是成功的。人工抗原的特异性还与其载体蛋白上连接的半抗原数目有关。通常每个载体蛋白上含有8～25个半抗原时能取得较好的免疫效果[9-11]。笔者测定了FFCHSBSA人工抗原结合比，计算出BSA与FFCHS的结合比为18.9∶1，属于最适结合比范围之内，从理论上来看应该得到效价较高的抗体。笔者采用低速离心和透析来提高FFCHSBSA人工抗原的纯度，离心除去变性的载体蛋白，用PBS对FFCHSBSA透析2 d，除去了未反应的氟苯尼考、琥珀酸酯等小分子，保证了FFCHSBSA人工抗原的纯度。

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