沙门氏菌效应蛋白SopB 288～309肽段介导SopB依赖的HeLa细胞AKT的磷酸化研究

李晔　张西轩　阮海华

摘要 [目的]研究沙门氏菌效应蛋白SopB中跨膜疏水结构域288-309肽段对受SopB诱导的HeLa细胞Akt磷酸化激活中的功能。[方法]通过重叠延伸PCR的方法构建SopB第288～309位肽段缺失突变基因，并将该基因在HeLa细胞中进行异位表达，与野生型SopB基因进行比较，确定缺失的第288～309位间肽段在受SopB诱导的Akt磷酸化激活中的作用。[结果]与空载体对照相比较，在HeLa细胞中表达野生型SopB重组质粒明显激活了pAkt473的磷酸化，而在HeLa细胞中表达SopB缺失突变体SopBΔ288-309时，则检测不到pAkt473的磷酸化激活。[结论]SopB表达激活HeLa细胞pAkt473的磷酸化与其第288～309位肽段的功能直接相关，该跨膜疏水结构域的缺失导致SopB蛋白不能亚细胞定位至细胞膜，从而导致SopBΔ288-309对pAkt473磷酸化激活功能的丧失。

关键词 沙门氏菌属；SopB；AKT的磷酸化

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）03-00660-03

沙门氏菌效应蛋白SopB 是由沙门氏菌SPI-1 Ⅲ型分泌系统分泌的一种由561个氨基酸构成的蛋白质分子，是一种肌醇磷脂酶，是目前沙门氏菌分泌的效应蛋白中研究最多、功能最多样化的一个蛋白[1-5]。沙门氏菌效应蛋白SopB 首先作用于质膜，激活SH3-鸟核苷酸交换因子（SGEF），间接活化交换因子RhoG，从而进一步激活肌动蛋白，诱导细胞骨架重排，促使沙门氏菌侵入宿主细胞[6]。沙门氏菌效应蛋白SopB 能够激活原癌基因Akt473 的磷酸化，对细菌入侵介导的细胞凋亡具有抑制作用，促进宿主细胞的存活，为沙门氏菌在宿主细胞中的存活提供条件[7]。同时，SopB 通过招募RAB5 和VPS34 到SCV（Salmonella-Containing Vacuole，SCV），促进SCV在宿主细胞内的形成和成熟，这对沙门氏菌在宿主细胞内的存活与复制具有重要的意义[8]。研究表明，沙门氏菌效应蛋白SopB在感染宿主细胞后能够发生泛素化修饰，该泛素化修饰在沙门氏菌感染宿主细胞的过程中发挥重要的作用[9-10]。利用结构预测算法（TMpred prediction algorithm）软件分析发现沙门氏菌效应蛋白SopB 第288～309位氨基酸之间的肽段拥有较强的跨膜螺旋结构域。该跨膜结构域被证实与效应蛋白SopB的泛素化修饰直接相关[9]。为了深入研究该SopB跨膜结合结构域在沙门氏菌感染过程中是否与受SopB诱导的Akt的磷酸化修饰和激活有关，笔者利用重叠延伸PCR的方法构建SopB基因第288～309位肽段缺失的突变体，即SopBΔ288-309缺失突变体，并与野生型SopB蛋白的功能进行比较，以期确定该肽段与受SopB诱导的Akt的磷酸化修饰和激活之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株、宿主细胞和质粒载体。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium LT2）、大肠杆菌（Ecoli）Trans 10、pCDNA4.0质粒载体、pCDNA4-SopB重组质粒和HeLa细胞，均由天津市食品生物技术重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂。质粒DNA提取试剂盒和胶回收试剂盒，购自英国Omega公司；Vent DNA polymerase、限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ，均购自美国NEB公司；T4 DNA连接酶，购自美国Promega公司；细胞转染试剂Vigofect，购自威格拉斯生物技术（北京）有限公司；引物，由上海生工生物技术有限公司合成；其他试剂均为国产分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pcDNA4-SopBΔ288-309突变体的构建。根据NCBI数据库公布的Salmonella Typhimurium str.LT2的SopB基因编码序列（GenBank号为AE006468.1），利用 Primer 5.0 软件设计2对引物（表1）。以pCDNA4-SopB重組质粒为模板，分别利用P1、P3引物对以及P2、P4引物对扩增编码SopB 0～288蛋白的基因片段以及编码SopB 309～561蛋白的基因片段。2个片段进行PCR反应的扩增条件均为：94 ℃，6 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，1 min，30 个循环；72 ℃，10 min。琼脂糖凝胶电泳检测并分别回收纯化 PCR 产物。最后利用P1、P2引物对，以等量的上述2种PCR产物为模板扩增SopBΔ288-309缺失突变体编码基因。PCR反应条件为：94 ℃，6 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，2 min，30 个循环；72 ℃，10 min。琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化 PCR 产物。用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切并纯化酶切后的片段，同时将质粒 pCDNA4.0也经同样双酶切和纯化。最后，将pCDNA4与SopBΔ288-309基因片段的酶切纯化产物用 T4 连接酶体系连接，转化 Trans 10 大肠杆菌感受态细胞，涂布于含 Ampr的 LB 平板上，37 ℃培养12～16 h。挑取单个菌落接种于含 Ampr的 LB 液体培养基中，37 ℃、200 r/min 振荡过夜，酶切鉴定，获得pCDNA4-SopBΔ288-309重组质粒，测序确认插入序列正确。

1.2.2 质粒转染HeLa细胞。参照的方法[11-12]。

1.2.3 HeLa细胞pAKT473激活情况的检测。参照文献的方法[13]，收集分别转染pCDNA4-SopB野生型质粒和pCDNA4-SopBΔ288-309突变体质粒24 h后的HeLa细胞，将细胞加等体积2×SDS载样缓冲后，沸水浴煮沸5 min，离心1 min后进行10% SDS-PAGE电泳，转膜，利用兔源抗pAkt473的一抗和羊抗兔二抗进行免疫印迹杂交，洗膜，最后通过ECL化学发光试剂盒进行X光片压片，洗片。同时利用Akt抗体作为对照。

2 結果与分析

2.1 SopBΔ288-309突变基因的扩增 利用pCDNA4-SopB重组质粒作为模板，分别以P1、P3引物对和P2、P4引物对进行PCR扩增成功获得编码SopB 0～288蛋白序列的基因片段（图1泳道1、2、3和4）以及SopB 309～561蛋白序列的基因片段（图1泳道5、6、7和8）。从图中可以看出，2种PCR片段的长度均在DNA marker的大小为750 bp的条带附近，而且编码SopB 0～288蛋白片段的PCR扩增产物的分子量（预期片段长度 864 bp）比编码SopB 309～561蛋白片段的PCR扩增产物的分子量（预期片段长度 756 bp）略大一些，与预期结果相吻合。继续以上述2种回收的PCR片段作模板，利用引物对P1、P2对其进行PCR扩增发现，成功扩增出了与预期的SopBΔ288-309片段长度（1 620 bp）接近的PCR产物（图2）。试验结果表明，通过重叠延伸PCR的方法即利用2种PCR片段作为模板，2个片段之间各有1段20 bp左右的互补的序列，可以成功的获得去掉288～309位间氨基酸片段的SopBΔ288-309基因片段。

3 结论与讨论

试验利用重叠延伸PCR的方法构建了沙门氏菌效应蛋白SopB跨膜疏水片段288～309肽段缺失质粒，并利用该质粒与野生型SopB蛋白的功能进行比较，研究了该疏水肽段对HeLa细胞pAkt473激活的影响。结果发现，该疏水肽段对于SopB依赖的HeLa细胞pAkt473的激活是必需的。2009年，Patel等的研究发现，沙门氏菌效应蛋白SopBΔ288-309缺失菌株感染宿主细胞后，SopBΔ288-309蛋白不能够发生与野生型SopB类似的泛素化修饰，表明SopB跨膜结构域288～309肽段与SopB蛋白的泛素化修饰直接相关，进一步研究该跨膜结构域与SopB亚细胞定位有关[9]。当SopB缺失第288～309位肽段后，该SopB 缺失突变体能够被分泌至宿主细胞中，而且该突变体的分泌量略低于野生型SopB蛋白。亚细胞定位研究表明，SopBΔ288-309突变体主要被转运至细胞的胞浆，与野生型SopB定位于细胞膜，胞浆以及SCV完全不同[9]。基于此

推测，288～309跨膜螺旋结构域与SopB亚细胞定位至细胞

膜有关，当突变体不能定位至细胞膜以后，SopB蛋白的泛素化也随之消失。试验利用穿梭质粒在HeLa细胞中表达SopBΔ288-309突变体时发现该跨膜疏水片段与HeLa细胞pAkt473的激活直接相关。推测SopB对pAkt473磷酸化激活的功能依赖于其定位于宿主细胞膜，当SopB不能够亚细胞定位至细胞膜时会导致其激活功能的丧失。SopBΔ288-309的表型不像是由于该疏水跨膜结构域的缺失导致的蛋白整体构象的变化，因为纯化的SopBΔ288-309突变体仍然具有与野生型SopB类似的肌醇磷脂酶活性[9]，但是该实验也不能排除另一种可能就是该段序列的去除可能影响到SopB局部构象的变化，例如改变了SopB与其他蛋白间的相互作用，而这些想相互作用与SopB和膜的结合有关。综上所述，试验建立了一种利用重叠延伸PCR的方法构建蛋白的缺失突变体，为蛋白质功能的研究提供了一种可靠的手段。

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