羧甲基壳聚糖专属性检验方法研究及应用

曹秀荣尹乃达彭国富

论著·实验研究

羧甲基壳聚糖专属性检验方法研究及应用

曹秀荣1尹乃达2彭国富3

目的探讨羧甲基壳聚糖的定性鉴别及含量测定的专属性方法。 方法本文将红外光谱法、乙酰丙酮法、二硝基水杨酸比色法这三种方法结合起来，从化学结构、特异性显色及含量测定方面对其羧甲基壳聚糖进行特异性鉴别及含量测定研究。 结果 该方法简单、快速、准确，能广泛用于羧甲基壳聚糖及其制品的检验。结论给后续羧甲基壳聚糖国标或行标的制定提供参考。

羧甲基壳聚糖；鉴别；含量；专属性

1 前言

羧甲基壳聚糖是壳聚糖与氯代乙酸在一定条件下反应得到的水溶性壳聚糖产物，具有良好的吸湿性、保湿性、成膜性以及生物相容性，羧甲基壳聚糖及其制品（敷料）目前广泛用于食品、化妆品、医药等领域[1,2]，羧甲基壳聚糖及其制品（敷料）广泛用于在医学领域，特别是临床骨科领域，如开放性骨科手术、脊柱骨手术、内置骨钉、骨板手术、人工关节置换手术等都有临床应用。对于外皮层缝合后，羧甲基壳聚糖及其制品（敷料）能起到止血、止痛、抑菌、促进伤口愈合的作用。在换药过程不粘连伤口，避免造成伤口二次损伤；减少疤痕形成。对于骨科长期卧床引起的褥疮伤口后期，也有治疗作用。壳聚糖用作复合仿生材料可以有效增强壳聚糖自身机械性能及溶剂性能，在骨科修复及整个医疗领域都会越来越受到人们的关注[3]。

目前，羧甲基壳聚糖定性鉴别以及含量测定方法，尚无严格的国家标准或行业标准参考，研究者们多以单一的方法尝试建立标准测试方法，例如用于羧甲基壳聚糖结构鉴定的方法有红外光谱法[4]、核磁光谱法等，用于羧甲基壳聚糖含量测定的方法有乙酰丙酮法[2]、斐林试剂法、硫酸蒽酮法、二硝基水杨酸比色法[5]等。然而，这些方法对于单一组分的羧甲基壳聚糖的结构鉴定以及含量测定准确度高，但是对于复杂体系下羧甲基壳聚糖的结构鉴定以及含量测定往往差异性大，难以满足检验的要求。为此，我们利用羧甲基壳聚糖结构鉴定的方法，借鉴含量测试方法中乙酰丙酮法中的显色反应，结合二硝基水杨酸比色法，综合提出羧甲基壳聚糖的专属性检验方法。该方法简单、快速、准确，能广泛用于羧甲基壳聚糖及其制品的检验。

2 实验材料与方法

2.1 仪器与试剂

主要仪器：紫外可见分光光度计（UV-1750型，岛津企业管理（中国）有限公司）；傅立叶变换红外光谱仪（Nicolet5700型，美国热电公司）。

主要试剂：羧甲基壳聚糖、瑞蒙复壳聚糖医用生物创面修复膜产品（人福医药集团医疗用品有限公司），其它试剂均为国产商品试剂，分析纯。

2.2 红外光谱测试

将羧甲基壳聚糖粉末与KBr粉末研磨压片，置于傅里叶变换红外光谱仪样品室，在4000～400cm-1范围进行扫描。

2.3 显色反应测试

乙酰丙酮溶液配制：取乙酰丙酮3.5 ml，加入1 mol/L碳酸钠溶液至50 ml，摇匀混溶即可。对-二甲氨基苯甲醛溶液配制如下：取对-二甲氨基苯甲醛固体0.8g，加无醛乙醇15ml及盐酸15 ml，摇匀备用

分别取羧甲基壳聚糖①、羧甲基纤维素钠②、聚乙烯醇③、瑞蒙复壳聚糖医用生物创面修复膜产品去掉羧甲基壳聚糖膜层后剩余敷芯层④、瑞蒙复壳聚糖医用生物创面修复膜⑤作为测试样品。①、②、③组各配置成5%的溶液，取出2 ml置于100ml锥形瓶中；④、⑤两组直接置于100ml锥形瓶中，各加入浓盐酸20 ml、再补加去离子水20 m（l滴加时冲净残留在瓶口周围的浓盐酸），稍加振摇后用白胶塞或特氟龙瓶塞塞紧。将上述5组锥形瓶置于高压蒸汽灭菌锅中，120℃下水解2小时后取出冷却至室温。取④、⑤上层清液各5 ml于两只50 ml烧杯中，用6mol/L氢氧化钠溶液中和至中性后作为检验样液及对照液备用。

乙酰丙酮法显色：分别取上述检验样液各1 ml于10 ml比色管中，并加5.0 ml去离子水稀释之。再加乙酰丙酮溶液各1.0 ml，摇匀，同时置于沸水浴中加热约25分钟后一并取出，在流动水下迅速冷却；再各加对-二甲氨基苯甲醛溶液1.0 ml，补充无醛乙醇至10 ml，摇匀，在60℃水浴中保温1小时后放冷比色，观察比色结果。

斐林试剂法显色：分别取上述检验样液2ml置于试管中，加5.0 ml去离子水稀释后，再加斐林试剂0.2ml，摇匀后于沸水浴中加热约2～3分钟后取出，观察显色结果。

2.4 二硝基水杨酸（DNS）比色法测羧甲基壳聚糖含量

配置DNS试剂：甲溶液：溶解6.9 g结晶酚于15.2 ml 10 %氢氧化钠中并加水稀释至69 ml，再向此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠；乙溶液：溶解255 g酒石酸钾钠于300 ml 10%氢氧化钠中，再加入880 ml浓度为1%的3,5-二硝基水杨酸溶液。将甲乙溶液混合即成DNS试剂。

反应原液制备：取瑞蒙复壳聚糖医用生物创面修复膜，剪成2.5cm×2.5cm置于100ml锥形瓶内，添加20ml浓盐酸和20ml纯净水，封口后120℃高温蒸汽水解反应。待冷却后过滤取得其上清液体，用氢氧化钠中和至中性，得到反应原液。

标准工作曲线建立：从2%羧甲基壳聚糖溶液中分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置于10 ml试管中，加水至2ml，再分别加入0.1%氢氧化钠一滴，加入DNS试液1ml，混匀置沸水浴中显色5分钟，冷却后加水稀释至10ml，以空白为对照，于520 nm处测定吸收值，建立标准工作曲线。

样品中羧甲基壳聚糖含量测试：分别取1、2、3ml反应原液置于10ml试管中，加入1 mlDNS试剂，混匀置沸水浴中显色5分钟，冷却后加水稀释至10 ml，以空白为对照，于520 nm处测定吸收值，并根据标准工作曲线，计算含量。

3 结果与讨论

3.1 红外光谱

图1为羧甲基壳聚糖红外光谱图。图1显示，1602 cm-1处出现强吸收峰，归属于羧甲基壳聚糖分子链上COO—反对称伸缩振动峰（约1550 cm-1）与NH2变形振动峰（1599 cm-1）重叠形成。1115 cm-1（C-O-C）、1081cm-1（C-O-C）、893cm-1（NH）吸收峰的出现，表示羧甲基在壳聚糖2位氨基、6位羟基同时发生取代。

图1 羧甲基壳聚糖红外光谱图

3.2 显色反应

羧甲基壳聚糖水解成氨基葡萄糖后，在碱性条件下加热，乙酰丙酮将氨基葡萄糖分子2号碳位上的氨基乙酰化，生成带有吡咯环的 N-乙酰衍生物。此衍生物与对二甲氨基苯甲醛反应，反应物呈现红色。图2是各种样品的乙酰丙酮显色图。从图中可以看出，纯羧甲基壳聚糖呈现桃红色，瑞蒙复壳聚糖医用生物创面修复膜呈现紫红色，两组含有羧甲基壳聚糖的样品都呈现出氨基葡萄糖的特异性颜色反应（红色），而不含有羧甲基壳聚糖的样品呈现黄色。(图2各种样品的乙酰丙酮法显色图详见插页）

羧甲基壳聚糖水解成氨基葡萄糖后，氨基葡萄糖与Cu2+作用，将其还原成Cu+，形成Cu2O砖红色沉淀。图3是各种样品的斐林试剂显色图。从图中可以看出，纯羧甲基壳聚糖呈现砖红色，而其它几种含羧甲基壳聚糖或不含羧甲基壳聚糖组分的样品均呈现不同的颜色：羧甲基纤维素钠呈现淡蓝色、聚乙烯醇呈现淡蓝混浊、不含羧甲基壳聚糖敷芯呈现绿色、瑞蒙复壳聚糖医用生物创面修复膜呈现淡橙色。砖红色沉淀是还原性单糖的特异性颜色反应，纯羧甲基壳聚糖因其水解成还原性单糖，所以呈现此颜色反应。然而含有羧甲基壳聚糖的瑞蒙复壳聚糖医用生物创面修复膜由于其它高分子组分的呈色干扰，颜色变为淡橙色。其它不含羧甲基壳聚糖呈现蓝绿色色系。由此可以看出，斐林试剂显色法用于鉴别羧甲基壳聚糖，其呈色易受到其它成分的影响而呈现非特异性颜色反应。相比较而言，乙酰丙酮法更合适用于羧甲基壳聚糖的鉴别反应。（图3各种样品的斐林试剂显色图详见插页）

3.3 DNS法测羧甲基壳聚糖含量

标准工作曲线的建立：羧甲基壳聚糖溶液浓度分别为0.6、0.8、1.2、1.6、2.0 ml的测试溶液，对应测得的吸光度测得值分别为0.314、0.624、0.941、1.217、1.607。对上述5组数据进行线性拟合，得到拟合方程，即标准工作曲线方程，为：y=0.01969+1.25485x，r2=0.99864。

反应原液取量分别为1、2、3 ml，测得的吸光度分别0.028、0.051、0.092代入标准方程计算其浓度分别为0.0548、0.0836、0.1351mg/ml，结合测试反应原液体积以及所使用的瑞蒙复壳聚糖医用生物创面修复膜规格数据，计算瑞蒙复壳聚糖医用生物创面修复膜中羧甲基壳聚糖平均含量为1.133mg/cm2，跟该产品配方用羧甲基壳聚糖配比接近，说明其方法用于羧甲基壳聚糖含量测定时具有较高的准确性。

4 结论

市场上羧甲基壳聚糖及其制品越来越多，用途越来越广泛，因此建立行之有效的检验方法显得尤为必要。本文从羧甲基壳聚糖鉴别及含量测定特异性方法入手，以红外光谱法表征羧甲基壳聚糖化学结构，以显色方法（斐林试剂法和乙酰丙酮法）鉴别羧甲基壳聚糖的存在，以二硝基水杨酸比色法测定羧甲基壳聚糖的含量。结果表明，斐林试剂法由于受到非羧甲基壳聚糖组分的干扰，呈色偏离砖红色（目标色），偏差大。而其它几种方法如红外光谱法、乙酰丙酮法、二硝基水杨酸比色法都表现出特异性特征。因此，将红外光谱法、乙酰丙酮法、二硝基水杨酸比色法结合起来，分别从羧甲基壳聚糖基本化学结构、特异性显色反应、含量测定方面，对其进行定性鉴别及含量测定，形成羧甲基壳聚糖专属性检验方法。该方法简单、快速、准确，能广泛用于羧甲基壳聚糖及其制品的检验。

[1] 蒋挺大.壳聚糖[M].北京：化学工业出版社，2006，12-40.

[2] 刘万顺，崔丽华，贺君等.羧甲基壳聚糖中氨基葡萄糖含量测定方法的研究[J].中国海洋大学学报，2004，34（5）：811-815.

[3] 周剑，汤健，李全利.壳聚糖在骨组织工程中的应用进展[J].医学综述，2010，15：2047-2249.

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[5] 邹巧根，韦萍，邹珊等.羧甲基壳聚糖的含量测定[J].药物生物技术，2008，15（1）：59-63.

Research and application of carboxymethyl chitosan specificity detection

Cao Xiurong1,Yin Naida2,Peng Guofu3.1Hubei Food and Drug Administration,Wuhan Hubei,430064;2Humanwell Medical Group Medical Supplies Co.,Ltd,Wuhan Hubei,430206;3Laboratory of Biological Functional Dressings of Hubei Province,Wuhan Hubei,430064,China

Objective The paper is seeking for a method of identification and determination of content of carboxymethyl chitosan.Methods Three methods including Infrared Spectroscopy Way,Acetyl Acetone Way and Dinitrosalicylic Acid Way are combined to identify and determine the content of carboxymethyl chitosan from three aspects,including chemical structure，specific color and content determination.Results The result shows that we could get the result conveniently and quickly，and the result is accurate by the way.Conclusion The method could be a important reference for draft of national standards or industry standards of carboxymethyl chitosan

Carboxymethyl chitosan;Identification;Content;Specificity

R318.08

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2014.04.005

swgk2014-03-0045

曹秀荣(1972-)女，本科，高级工程师。工作方向：医疗器械产品注册审评。

2014-03-24）

1湖北省食品药品监督管理局药品审评认证中心，湖北武汉430064；2人福医药集团医疗用品有限公司，湖北武汉430206；3人福医药集团医疗用品有限公司，生物功能性敷料创制湖北省工程实验室，湖北武汉430206