人参黑斑病生防用内生拮抗菌分离鉴定及发酵浓缩液的性质

贾斌，赵贞丽，沈国娟，屈俊亭，李熙英

(1.延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林 延吉 133002;2.延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

人参 Panax ginseng C.A.Mey.为名贵中药，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神之功能[1］。国内外已有描述的人参病害有40多种，其中人参黑斑病Alternaria panax是人参地上部发生最普遍、危害最严重的病害之一。主要危害人参的叶片、茎、果实及根，常年发病率为20% ～30%，严重时90%以上，可造成人参早期落叶、植株提前枯萎，参籽质量变劣、不能结实，参根减产 30% ～80%[1－3］。

以往人参黑斑病的防治主要采用化学防治，但化学防治防效不高、不稳定，并出现农药残留、环境污染等问题。国内对生物防治人参其它病害(主要是锈腐病)方面有较多报道[4－6］，但有关人参黑斑病生物防治方面报道较少[7－11］。本试验通过室内抑菌试验分离筛选对人参黑斑病具有较强抑菌活性的拮抗细菌，并研究其发酵浓缩液的性质，为人参黑斑病生物防治打基础。

1 材料与方法

1.1 供试病原菌和分离材料 植物病原菌有人参黑斑病菌Alternaria panax、人参锈腐病菌Cylindrocarpon destructans、人参灰霉病菌 Botrytis cinerea，水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani，杨树烂皮病菌Cytospora chrysosperma，水稻恶苗病菌Fusarium moniliforme，由延边大学农学院植物病理研究室提供。分离材料有人参根茎叶、委陵草根茎叶、狗参根、菖蒲根、龙须草根等，于6—7月在延边地区的安图、珲春、图们等地采集。

1.2 内生拮抗细菌的分离 分离材料用70%酒精表面清洗后剪成5～10 mm小段，70%乙醇和0.1%升汞表面消毒后置于PDA平板上培养36 h。挑选未长出微生物菌落的小段1 g放在加入9 mL灭菌水的研钵中碾碎后，取上清液梯度稀释至10－2，10－3，10－4，然后取其稀释液均匀涂抹于 PDA 和 NA培养基平板上，每个处理重复3次。在25℃恒温培养箱中培养3～5 d后，根据菌落形态、颜色、质地等对微生物菌株数和菌落数进行统计，并将不同种类的微生物进行划线纯培养后保存作为参试菌株。

1.3 人参黑斑病生防用拮抗菌筛选 PDA平板上培养7 d的人参黑斑病菌菌落用打孔器打出直径7 mm的菌碟，放置于新的PDA平板中间，在距黑斑病菌菌碟左右两侧20 mm处点接内生菌菌株，以只接病原菌的作对照，每个处理重复5次，置于25℃恒温箱中培养。培养第6天时测人参黑斑病菌菌落宽度，计算抑菌率，筛选出抑菌效果好的拮抗菌株。

1.4 拮抗菌鉴定

1.4.1 拮抗细菌的形态观察及生理生化鉴定 对BJ33进行菌落形态观察、液体培养特性、革兰氏染色、芽孢染色、运动性试验、接触酶试验、厌氧生长试验、V-P测定、淀粉水解试验、明胶液化试验、糖类发酵试验、耐盐性试验、生长pH试验、生长温度试验、柠檬酸利用试验、丙酸盐利用试验[12－14］。

1.4.2 拮抗细菌16S rDNA序列及系统发育分析以BJ33菌株DNA为模板，利用16S rDNA的一对通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')为探针对16S rDNA序列进行分析。16S rDNA序列测定委托“北京三博远志生物技术有限责任公司”进行，获得长度为1445bp的16S rDNA序列。将该DNA序列在NCBI GenBank上利用BLASTN模块进行BLAST，对BJ33菌株的16S rDNA序列进行同源性分析。根据BLAST结果，选择与BJ33在16S rDNA序列上同源性最高(序列同源性均超过99%)的前20个菌株的16S rDNA序列，连同BJ33的16S rDNA序列一起，利用DNAStar分析软件建立系统发育树。

1.5 BJ33菌株及发酵浓缩液对6种植物病原菌菌丝生长的抑制作用

1.5.1 BJ33菌株的抑制作用 采用打孔法，用人参黑斑病菌、人参锈腐病菌、人参灰霉病菌、水稻纹枯病菌、水稻恶苗病菌和杨树烂皮病菌进行抑菌试验(方法同1.5.2)。

1.5.2 BJ33菌株发酵浓缩液的抑制作用 把活化2 d的BJ33菌株接种于200 mL KB液体培养液中，在28℃，120 r/min恒温双层摇床中振荡培养5 d后，4000 r/min离心25 min，取上清液浓缩至20 mL，再用直径0.22 μm微孔滤膜过滤，即为拮抗菌发酵浓缩液。

用人参黑斑病菌、人参锈腐病菌，人参灰霉病菌，水稻纹枯病菌、水稻恶苗病菌和杨树烂皮病菌进行抑菌试验。发酵浓缩液的抑菌活性采用打孔法测定。具体方法如下:先在PDA平板中间放置直径7 mm的病菌菌碟1片，在距菌碟边缘两侧20 mm处用直径7 mm的无菌打孔器打孔(2孔对称)，用移液器取100 μL浓缩液注入此小孔中，置于恒温培养箱中培养，只接病菌菌碟的为对照，每个处理重复5个培养皿。某一对照长满培养皿时测病菌菌落直径，计算抑菌率。

1.6 BJ33菌株发酵浓缩液在不同温度和不同pH值条件下的抑菌作用

抑菌作用采用打孔法测定。

1.6.1 不同温度 接种人参黑斑病菌并注入发酵浓缩液后放置15，20，25，30℃恒温培养箱中培养6 d后测定病菌菌落直径，计算抑菌率。

1.6.2 不同pH 配置自然pH及pH值为5，7，9，11的PDA培养基。接种人参黑斑病菌并注入发酵浓缩液后在25℃下培养6 d，之后测人参黑斑病菌菌落直径，计算抑菌率。

1.7 BJ33菌株发酵浓缩液的稳定性用打孔法测定发酵浓缩液的抑菌活性(见1.5.2)。

1.7.1 对热的稳定性 分别取5 mL发酵浓缩液在100℃水浴锅中分别处理30，60，90 min和121℃高压灭菌30 min，以未处理的发酵浓缩液为对照，测定其抑菌活性。

1.7.2 对紫外线的稳定性 取5 mL发酵浓缩液放在培养皿中，置于超净工作台上，打开紫外灯(18 W)，样品与紫外灯距离为45 cm，分别照射8，16，24 h，以未经紫外线照射的发酵浓缩液为对照，测其抑菌活性。

1.7.3 对蛋白酶的稳定性 配制2 μg/mL胃蛋白酶、蛋白酶 K、胰蛋白酶水溶液，取5 mL与拮抗细菌发酵浓缩液1∶1混合，对照加蒸馏水。蛋白酶处理的pH调节至3，其他调节至pH 7，在37℃下反应1 h后60℃水浴。冷却后将胃蛋白酶处理调节至pH7，并将所有处理定容至同一体积后测抑菌活性。

1.8 抑菌作用的显微观察 将BJ33菌株与人参黑斑病菌接种在PDA平板对峙培养，25℃培养5～6 d，显微镜下观察人参黑斑病菌菌丝生长受抑制部位的变化并拍摄照片。

2 结果与分析

2.1 人参黑斑病生防用内生拮抗菌的分离及筛选不同植物组织内分离到的拮抗细菌数目见表1。从供式5种材料中均分离到了内生菌和内生拮抗菌，总共分离到82株内生细菌菌株，其中55株为拮抗细菌。人参根中的内生菌(含拮抗菌)菌株数最多，其次为山芍药中的内生细菌(含内生拮抗细菌)菌株数。

表1 不同植物组织内分离到拮抗菌数目

分离到的55株拮抗菌中5株对人参黑斑病菌菌丝生长的抑菌率50%以上(见表2)。其中BJ33菌株的抑菌率最高，达到了80%;其次为BJ59和BJ68，其抑菌率为60%和59.17%。

表2 5株拮抗菌菌株对人参黑斑病菌的抑菌作用

2.2 拮抗细菌BJ33的形态观察及生理生化特性BJ33菌株呈杆状、革兰氏染色阳性、产芽孢，芽孢中生或近中生、孢囊膨大不明显、有运动性。在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24 h后形成圆形边缘不规则的扁平状菌落，表面粘稠无褶皱，不透明，而其在水溶液中培养，有菌膜、沉淀产生，溶液变浑浊。

BJ33菌株的接触酶反应为阳性;能在pH为5.7、含盐量为10%的有氧环境中生长，不能在厌氧环境中生长;氧化发酵试验产酸不产气;V-P试验为阳性;能水解明胶和淀粉;能利用柠檬酸盐但不能利用丙酸盐。

2.3 BJ33菌株的16S rDNA序列及系统发育分析在NCBI Genbank上进行的16S rDNA序列分析结果表明，BJ33菌株属于芽孢杆菌属Bacillus;与BJ33菌株16S rDNA序列(GenBank登录号为KF964025)同源性超过99%的菌株有104个。其中，有10个菌株(GenBank登录号分别为 HM107808，JQ062537，HQ844503，KF482859，JQ229807，JQ062537，HM107807，KC441776，KC441756 和 JQ308548 等)与BJ33在16S rDNA序列上的同源性都达到99.9%，BLAST得分在4643和4651之间，E-value均为0;这10个菌株中，除JQ308548为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis外，均为解淀粉芽孢杆菌(见图1和表3)。从发育树上看，BJ33与解淀粉芽孢杆菌Strain 15(B.amyloliquefaciens)(GenBank登 录 号:HM107808)和解淀粉芽孢杆菌 Strain D8(B.amyloliquefaciens)(GenBank登录号:KC441756)的系统发育关系最近;不过，这两个菌株与BJ33的16S rDNA序列BLAST得分(Max Score分别为2643和2647)并非最高;在所有与BJ33在16S rDNA序列同源性分析中BLAST得分最高(Max Score为4651)的为解淀粉芽孢杆菌Strain S2QPS11(B.amyloliquefaciens)GenBank登录号:HQ844503.1)。根据16S rDNA序列同源性分析、系统发育分析结果，结合菌株形态学及培养特征，初步将菌株BJ33鉴定为解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens。

图1 BJ33菌株系统发育树

表3 BJ33与20个菌(株)的16S rDNA序列一致性

2.4 BJ33菌株及其发酵浓缩液对6种植物病原菌菌丝生长的抑制作用 BJ33菌株与6种植物病原菌的室内对峙培养结果见表4。

表4 BJ33菌株对6种植物病原菌的抑菌效果

BJ33菌株对供试6种植物病原菌均具有较强的抑菌活性，其中对人参黑斑病菌和杨树烂皮病菌的抑菌活性最强，其抑菌率为80%和79.6%;其次对水稻纹枯病菌的抑菌作用，其抑菌率为68.1%;再次为对人参灰霉病菌的抑菌活性，其抑菌率58.30%。从抑菌带的宽度上看，BJ33菌株对杨树烂皮病菌的最宽，为7.3 mm;其次为对人参锈腐病菌的，为5.4 mm;再次为人参灰霉病菌和人参黑斑病菌的，分别为4.0 mm和3.5 mm。

BJ33菌株发酵浓缩液与6种植物病原菌的室内对峙培养结果见表5。BJ33菌株的发酵浓缩液对供试的6种植物病原菌均具有较强的抑菌作用，其中对人参黑斑病菌的抑菌作用最强，其抑菌率为76.19%;对人参锈腐病菌的抑菌活性为68.18%。说明BJ33菌株及发酵浓缩液具有较宽的抑菌谱。

表5 BJ33菌株发酵浓缩液对6种植物病菌的抑菌效果

2.5 BJ33菌株发酵浓缩液在不同温度和pH值条件下对人参黑斑病菌菌丝生长的抑菌作用

2.5.1 不同温度 表6可见，BJ33菌株发酵浓缩液在15～35℃对人参黑斑病菌具有较强的抑菌作用，其中25℃时对黑斑病菌菌丝生长抑菌作用最强，但在20～35℃抑菌率差异不大，均在70%以上，说明发酵浓缩液在20～35℃均具有较强的抑菌活性。

表6 不同温度下BJ33发酵浓缩液对人参黑斑病菌菌丝生长的抑制作用

2.5.2 不同pH 表7可见，BJ33菌株发酵浓缩液在pH5～11均具有较强抑菌活性，其抑菌率均在60%以上，其中pH 7的条件下抑菌作用最强。说明BJ33菌株发酵浓缩液在pH 7左右的中性条件下抑菌活性强。

表7 不同pH值下BJ33发酵浓缩液对人参黑斑病菌菌丝生长的抑制作用

2.6 BJ33发酵浓缩液的稳定性

2.6.1 对热的稳定性 表8可见，BJ33发酵浓缩液在100℃恒温水浴60 min与未经热处理的对照之间抑菌活性没有显著差异，但100℃恒温水浴90 min后抑菌效果下降5.95%，而经过121℃高压灭菌30 min后抑菌率下降19.51%。说明BJ33发酵浓缩液中不仅含有耐高温的抑菌物质，还含有不耐高温高压抗菌活性物质。

2.6.2 对紫外线的稳定性 表9中可见，将发酵浓缩液在紫外线照射16 h与对照之间没有显著性差异，紫外线照射24 h后抑菌率虽有轻微的降低，但只下降了3.28%。说明BJ33发酵浓缩液中抑菌物质对紫外线照射不敏感。

表8 不同温度处理对BJ33菌株发酵浓缩液抑菌活性的影响

表9 紫外灯不同照射时间对BJ33菌株发酵浓缩液抑菌活性的影响

2.6.3 对蛋白酶的稳定性 表10中可见，用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K处理的BJ33菌株发酵浓缩液对人参黑斑病菌菌丝生长抑制作用无明显差异，其抑菌率分别降低了1.9%，4.31%和2.59%。说明BJ33菌株发酵浓缩液对1 mg/mL浓度的胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K不敏感。

表10 蛋白酶处理对BJ33菌株发酵浓缩液抑菌活性的影响

2.7 显微镜下BJ33菌株对人参黑斑病菌的抑菌作用 人参黑斑病菌和BJ33菌株对峙培养5～6 d后，病菌菌落生长受到明显抑制的部位用肉眼观察，菌丝颜色比正常菌落边缘的菌丝颜色要深;用光学显微镜观察，人参黑斑病菌菌丝畸形，如细胞膨大、直径变宽、长度变短，呈念珠状，有些细胞颜色比较深，并且未发现分生孢子(见图2)。

图2 人参黑斑病菌正常菌丝(A)和BJ33处理过的菌丝(B)对比(1000×)

3 讨论

内生菌是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部、不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。植物内生菌包括内生真菌和内生细菌[15］。内生菌在植物体内广泛存在，分布于植物的叶鞘、叶片、花、茎、果实和种子等器官、组织的细胞或细胞间隙中。对植物内生菌的研究始于19世纪中叶，在地球已知的多数高等植物中，每个物种都与多种内生菌共生[16］，说明了内生菌的普遍性。本试验中选用的5种在长白山地区药用植物组织中也都分离到了多种内生菌的内生拮抗细菌，其中人参根中分离到的BJ33菌株对人参黑斑病菌具有很强的抑菌活性。通过形态特性观察、生理生化试验以及16S rDNA测序和系统发育树分析，BJ33菌株初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

解淀粉芽孢杆菌在自然界中分布十分广泛，同时能够对多种真菌与细菌产生抑制作用，并且具有丰富的自身代谢产物[17－18］。研究BJ33菌株及发酵浓缩液的抑菌谱，对供试6种植物病原菌均具有较强抑菌活性，其中BJ33菌株对人参黑斑病菌和杨树烂皮病菌的抑菌活性最强，其抑菌率为80%和79.6%;对比其他5种病菌，BJ33菌株发酵浓缩液对人参黑斑病菌的抑菌作用最强。

本试验中BJ33菌株发酵浓缩液在不同温度和不同pH值下均能维持较好的抑菌效果，同时BJ33发酵浓缩液经过热处理、紫外线照射、蛋白酶处理后，抑菌效果基本稳定，说明BJ33发酵浓缩液具有良好稳定性。这与刘俏[19］、金海强[20］等关于解淀粉芽孢杆菌发酵液的研究基本吻合。

另外，BJ33菌株的抗菌活性物质的分离提纯及鉴定、田间病害防治中的应用方法以及防效等，有待进一步研究。

[1]杨昭霞，刘长宝，刘美良.东部山区人参常见病害的症状及防治[J］.农业与技术，2005，25(2):62 －63.

[2]吴连举.人参黑斑病的综合防治[J］.农业科技通讯，1991(1):27－27.

[3]傅俊范.药用植物病理学[M］.北京:中国农业出版社，2007:138.

[4]李刚，赵义涛，姜晓莉，等.EM菌对人参锈腐病的防治研究[J］.特产研究，2001，23(2):8 －9.

[5]白容霖.我国人参锈腐病综合防治研究进展[J］.植物保护，1990(2):40－43.

[6]吴连举，杨依军，武侠，等.利用土壤拮抗性微生物防治人参锈腐病[J］.中国生物防治，1999，15(4):166 －168.

[7]李勇，赵东岳，丁万隆，等.人参内生细菌的分离及拮抗菌株的筛选[J］.中国中药杂志，2012(11):1532 －1535.

[8]吴长宝，回云静，徐小明，等.枯草芽孢杆菌生物菌剂对人参病原菌室内抑菌实验研究[J］.人参研究，2010(4):11－13.

[9]崔立萍，丁元元，刘天鹤，等.人参黑斑病菌拮抗菌的筛选及抑菌活性测定[J］.吉林农业科技学院学报，2011(3):4－7.

[10]孙立晨，高郁芳，金明月，等.5种中药提取物对人参黑斑病菌的抑制作用[J］.农药，2008(6):452－453.

[11]王玲.EM菌发酵玉米秸秆条件优化及对人参黑斑病影响研究[D］.长春:吉林农业大学，2012:10－26.

[12]Buchanan R E，Gibbons N E.伯杰细菌鉴定手册[M］.8版.北京:科学出版社，1984:72.

[13]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M］.北京:科学出版社，2001:43－65.

[14]朱旭芬.现代微生物学实验技术[M］.杭州:浙江大学出版社，2011:198－239.

[15]Strobel G，Stierle A，Stierle D，et al.Taxomyces andreanae，a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific yew(Taxus brevifolia)[J］.Mycotaxon，1993(47):71－80.

[16]Strobel G，Daisy B.Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products[J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2003，67(4):491 －502.

[17]王军华，权春善，徐洪涛，等.解淀粉芽孢杆菌Q-12抗真菌特性的研究[J］.食品与发酵工业，2006，32(6):47 －50.

[18]权春善，王军华，徐洪涛，等.1株抗真菌解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件的初步研究[J］.微生物学报，2006，46(1):7－12.

[19]刘俏，权春善，范圣第.超滤解淀粉芽孢杆菌发酵液提取抗菌物质的研究[J］.食品科技，2006(7):70－72.

[20]金海强.人参锈腐病生防用拮抗细菌分离鉴定及机理初探[D］.延吉:延边大学，2013:45 －52.