正交试验法优化南五味子木脂素提取工艺

黄 莹， 夏 恒

(1.武汉市汉口医院 药剂科，湖北 武汉 430012；2.广东药学院 中药学院，广东 广州 510080)



正交试验法优化南五味子木脂素提取工艺

黄 莹1， 夏 恒2

(1.武汉市汉口医院 药剂科，湖北 武汉 430012；2.广东药学院 中药学院，广东 广州 510080)

目的：筛选乙醇回流法提取南五味子木脂素的最佳工艺。方法：采用正交试验法，以五味子醇甲、五味子甲素、干浸膏含量为指标，考察提取溶剂、料液比、提取时间、提取次数对提取工艺的影响，优选最佳提取工艺。结果：最佳工艺为90%乙醇提取1次，提取时间为1.5h，料液比为1∶8。结论：该工艺操作简单，稳定性好，可用于工业化生产。

木脂素；正交试验；含量测定

南五味子为木兰科植物华中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果实，其性酸，味甘、温，归肺、心、肾经，为中医临床常用润肺、滋肾、止汗、止泻、涩精药，主治咳喘、自汗、盗汗、遗精、久泻、神经衰弱等症，临床应用广泛[1-2]。南五味子种子中含有五味子甲素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、乙、丙、丁、戊等木脂素类成分。近年来，高效液相色谱(HPLC)法测定五味子及其制剂中有效成分的研究报道较多，多集中在单个成分的测定上，两个及以上成分同时测定的文献报道较少。本研究优选五味子有效成分的提取工艺，对高效液相色谱条件进行优化，测定样品中五味子醇甲和五味子甲素的含量，结果表明该法快速、简便、灵敏度高、重现性好，为五味子的质量控制和开发利用提供了参考依据。

1 材料与仪器

1.1 试药与试剂

南五味子(批号130201，产地：湖南，广州至信中药饮片有限公司)；五味子醇甲标准品(批号：110857-201211)、五味子甲素标准品(批号：110764-201111)均购自中国食品药品检定研究院；水为蒸馏水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Waters1525泵高效液相色谱仪(Waters公司)；DS-II型电热三用水箱(北京市医疗设备厂)；101-1-BS电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；BS423S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)； SHZ-D(III)型循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；旋转蒸发器RE-52-99(上海亚荣生化仪器厂)；WS70-1型红外快速干燥器(上海浦东跃欣科学化工厂)；真空干燥器。

2 方法

2.1 色谱条件

BondapakTM C18色谱柱(3.9mm×300mm，5μm)，以甲醇为流动相A，以水为流动相B，检测波长为250nm，流速为1mL/min，柱温为25℃。测定五味子醇甲的流动相比例为甲醇∶水=55∶45，测定五味子甲素的流动相比例为甲醇∶水=65∶35，理论塔板数按五味子醇甲计算应不低于2 000。五味子醇甲和五味子甲素的出峰时间分别为9.4min和14.8min，如图1所示。

图1 五味子木脂素色谱

2.2 对照品溶液制备

取五味子醇甲和五味子甲素对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1mL含五味子醇甲0.388mg、五味子甲素0.305mg的对照品溶液。

2.3 标准曲线制备

分别取五味子醇甲和五味子甲素对照品溶液，按“2.1”项下条件进样，进样体积分别为3μL、5μL、10μL、15μL、20μL，记录色谱图，分别以对照品五味子醇甲、五味子甲素含量(μg)为横坐标(X)，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，进行线性回归，得到回归方程分别为：五味子醇甲：Y=328.1X-15.24(r=0.998)；五味子甲素：Y=268.3X-6.966(r=0.999)，表明五味子醇甲和五味子甲素分别在1.164～7.760μg、0.915～6.100μg进样量范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.4 样品溶液制备

称取南五味子15g，参考袁海龙[3]、王茹[4]等关于五味子甲素及五味子醇甲的最优提取条件筛选方法，按乙醇浓度90%，回流时间1h，提取次数2次，料液比1∶10的条件进行回流提取、滤过，合并滤液，减压回收乙醇并转移至500mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为样品溶液。

2.5 供试品溶液制备

精密吸取样品溶液20mL，蒸干，残渣用少量甲醇超声溶解，并转移到10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。按“2.1”色谱条件下分别测定五味子醇甲和五味子甲素的峰面积，计算正交试验下提取所得的五味子醇甲和五味子甲素含量。

2.6 干浸膏含量测定

精密量取样品溶液20mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴锅上蒸干，于105℃下干燥至恒重，冷却，精密称定重量，计算浸出物含量。

2.7 单因素试验设计

将南五味子按照不同浓度乙醇(0%、40%、80%、95%)，提取料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12)，提取次数(1、2、3、4次)，提取时间(0.5、1、1.5、2h)进行单因素实验。

2.8 正交试验设计

根据单因素试验优选结果，以乙醇浓度、提取料液比、提取时间、提取次数为研究对象，以五味子醇甲、五味子甲素总含量及干浸膏含量2个为研究指标，进行正交试验，确定最佳提取工艺参数，见表1。

表1 因素水平

3 结果

3.1 五味子木脂素测定条件优选结果

3.1.1 乙醇浓度选择 当乙醇浓度为0时，五味子甲素没有出峰，仅测得五味子醇甲的峰面积。由图2可知，在一定范围内，随着乙醇浓度的增大，五味子醇甲和五味子甲素的含量也随之升高，当达到95%时，其含量有下降趋势，因此，乙醇浓度应以80%为宜。

3.1.2 料液比选择 由图3可知，提取溶剂体积与中药材质量比越大，测得五味子醇甲和五味子甲素的含量也越高。当料液比达到1∶8时，两者含量增长呈现平缓趋势，故最佳料液比应选择1∶8。

3.1.3 提取次数选择 由图4可知，当采用乙醇连续提取2次后，总木脂素含量增长平缓，说明经过2次提取，已经基本将五味子中的木脂素醇甲和木脂素甲醇提取出来。因此，应选择提取2次为宜。

3.1.4 提取时间选择 由图5可知，总木脂素含量在提取时间为30～120min区间内随着时间的延长而增大。当提取时间达到60min后，木脂素含量增长幅度不甚明显，因此综合考虑选择提取时间为60min。

3.2 五味子木脂素含量测定工艺优化

根据单因素试验优选结果，以乙醇浓度、提取料液比、提取时间和提取次数为研究对象，以五味子醇甲、五味子甲素及干浸膏含量为研究指标，进行四因素三水平的正交试验L9(34)，确定最佳提取工艺参数，因素水平见表1。取南五味子15g进行回流提取，并合并提取液，定容至500mL量瓶中。按“2.5”项下方法制备供试品溶液，并进行含量测定，经过直观分析和方差分析，结果见表2和表3。

表2 L9(34)正交试验结果

实验号ABCD五味子总木脂素含量(mg/g)总固体(g)综合指标(%)111110.25170.102424.79212220.60430.103136.44313332.14400.123690.10421232.33680.101192.76522310.73690.120043.51623120.19840.099122.52731320.35950.096627.38832132.44690.079492.85933210.56140.091733.18K150.44348.31046.72033.827K252.93057.60054.12728.780K351.13748.60053.66391.903R2.4879.2907.40763.123

注：五味子总木脂素(mg/g)=五味子醇甲含量+五味子甲素含量。

综合评分(%)=(五味子总木脂素含量/最高含量)*100%* 0.8+(总固体/最高含量)*100%* 0.2。

表3 正交设计方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00,*P<0.05。

直观分析表明，影响南五味子木脂素提取的主要因素为提取时间，其次是提取料液比和提取次数，即各因素的影响程度大小依次为D>B>C>A。方差分析表明，提取时间对提取工艺有显著影响。故最终选定最佳工艺为A3B2C1D3，即90%乙醇，料液比为1∶8，提取1次，提取时间为1.5h。

3.3 最佳工艺验证试验

按照最佳工艺进行验证试验，称取南五味子15g，以8倍量90%乙醇加热回流提取1次，提取1.5h。平行3次试验，结果测得五味子两种木脂素含量和分别为2.465 0mg/g、2.438 9mg/g和2.403 9mg/g。结果表明该优选工艺稳定可行。

4 讨论

文献中五味子总木脂素的含量测定指标包括五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素等，由于本实验是以南五味子为提取对象，而南五味子中不含有五味子乙素，因此选取的指标为五味子醇甲和五味子甲素。在测定过程中笔者发现南五味子中五味子醇甲的含量明显高于五味子甲素。

在预实验期间，笔者对检测波长(216～254nm)和流动相比例(甲醇∶水=55∶45～80∶20)进行了筛选，并最终确定检测波长为250nm，五味子醇甲的流动相比例为55∶45，出峰时间为9.4min，五味子乙素的流动比例为65∶35，出峰时间为14.8min。之所以没有选择梯度洗脱，是因为五味子醇甲出峰范围较宽，在不同检测波长及流动相比例均能出峰，只有流动比例在55∶45时，五味子醇甲才能较好地与杂质峰分开。同时五味子乙素在流动相比例为55∶45的条件没有峰出现，因此本实验采用两次等度洗脱。

综上所述，该工艺操作简单，稳定性好，可用于木脂素的工业化生产。

[1] 李安金,耿加利.五味子药理作用研究概况[J].中华综合临床医学杂志,2004(4):117-119．

[2] 李晓光,高勤.五味子有效部位及其药理作用研究进展[J].中药材，2005,28(2):156-159．

[3] 袁海龙,谭锐,李仙逸,等.均匀设计法优选五味子的提取工艺[J].中国中药杂志,2002,27(5):355-358.

[4] 王茹,张琰,程建峰,等.五味子活性成分提取工艺的优选[J].华南国防医学杂志,2005,19(6):4-6.

(责任编辑：尹晨茹)

Orthogonal Experiment Method to Optimize the Extraction Process of Lignans in Schisandra Chinensis

Huang ying1，Xia heng2

(1.Pharmacy department of Wuhan Hankou Hospital, Wuhan 430012,China;2.College of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510080,China)

Objective:To screen the optimum process of ethanol reflux extraction of Lignans in Schisandra chinensis. Methods:Using the orthogonal experiment to test the effects of extraction solvent, material liquid ratio, extraction time, extraction times on extraction process, with the index of Schizandrin, Deoxyschizandrin and dry extract content, then optimized the best extraction process. Results:The optimum technology was 90% ethanol extraction, extraction time 1.5 h, and solid-liquid ratio of 1∶8. Conclusion:The process can be used for industrialized production, with simple operation and good stability.

Lignans; Orthogonal Experiment; Content Determination

2014-05-22

黄莹(1977-)，女，武汉市汉口医院主管药师 ，研究方向为医院药学。

R284.2

A

1673-2197(2014)18-0014-03