代谢型谷氨酸受体5 mRNA与脑梗死的相关性研究

杨巧莲等

【摘要】 目的：观察急性脑缺血大鼠脑组织中mGluR5 mRNA在不同时段的表达变化的规律，探讨mGluR5 mRNA与脑梗死的相关性。方法：75只雄性Wistar大鼠按照随机数字表法分为正常对照组、手术组1、3、6、12、24 h及3 d、14 d组及其相对应的假手术对照组，采用大鼠MCAO模型，利用原位杂交技术，检测各组mGluR5 mRNA的表达。结果：与正常对照组相比，假手术对照组mGluR5 mRNA表达无明显改变（P>0.05）。手术组mGluR5 mRNA各时间段表达均显著高于假手术对照组及正常对照组，缺血1 h其表达即有升高，比较差异均有统计学意义（P<0.01）。 mGluR5 mRNA 表达6 h达到高峰（F=5.328，P<0.00），3 d后表达开始下降（P<0.01），14 d基本降至正常对照水平（P>0.05）。结论：mGluR5在脑缺血后升高，提示mGluR5在脑梗死中有着重要作用，从而对我们的临床研究指出一条途径。

【关键词】 脑梗死； mGluR5； mRNA

谷氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，其受体介导神经毒性作用[1-2]。本研究以线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞模型，采用原位杂交技术对鼠脑mGluR5 mRNA进行检测，来观察谷氨酸受体在脑梗死中的动态变化规律，以待从基因水平为脑梗死治疗提供理论依据，从而针对相应不同环节进行基因敲除，早期遏制缺血性脑损害基本环节，为脑梗死的防治提供从理论到实践的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 mGluR5原位杂交检测试剂盒，胃蛋白酶，预杂交液，mGluR5寡核苷酸探针杂交液，封闭液，生物素化鼠抗地高辛，SABC-POD，生物素化过氧化物酶，DAB显色试剂盒，原位杂交专用PBS缓冲液。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物及分组 健康Wistar雄性大鼠75只，体重240～300g，由内蒙古大学动物试验中心提供。按照随机数字表法分为：正常对照组、脑缺血后1、3、6、12、24 h及3 d、14 d组（手术组）及相应的假手术对照组，每组5只。

1.2.2 动物模型制备 采用左侧大脑中动脉（MCAO）线栓法[3-4]。大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，取仰卧位固定于鼠台上，消毒后颈部正中切口，暴露左颈总动脉和颈内外动脉，结扎并切断颈外动脉，结扎翼腭动脉，血管夹夹闭颈内、颈总动脉，在颈总动脉近分叉处剪一约0.3 mm小口，将头部蘸硅橡胶的尼龙鱼线经小口处插入，沿颈内动脉入颅，进线从分叉处算约19～21 mm，稍感阻力时停止，此时已至大脑中动脉，结扎颈总动脉进线处，剪去多余的栓线，缝合手术切口。

1.2.3 脑组织的处理 于上述规定时间点，将大鼠深麻后快速断头取出脑组织，固定、脱水、浸蜡、包埋脑组织，再制成6 μm厚冠状切片。

1.2.4 进行原位杂交 将石蜡切片烤箱内过夜，经常规脱蜡至水，用胃蛋白酶混匀，经预杂交、杂交后洗涤，滴加封闭液、SABC及生物素化过氧化物酶，DAB显色后用苏木素复染后充分水洗，经酒精脱水、二甲苯透明后用树胶封片。

1.2.5 观察病理变化 在400倍显微镜视野下观察各组脑皮质缺血区相应的病理变化。

1.3 图像分析 采用江苏省捷达科技公司的形态分析系统进行图像分析，每张切片随机选取10个单位面积，测量原位杂交的灰度值。灰度值降低表明mGluR5 mRNA表达升高，灰度值越小，说明mGluR5 mRNA表达升高越明显，反之亦然。

1.4 统计学处理 采用SPSS 12.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原位杂交分析结果 与正常对照组相比，假手术对照组mGluR5 mRNA表达无明显改变（P>0.05）。手术组与正常对照组和假手术对照组相比，脑缺血后1 h缺血皮质区mGluR5 mRNA灰度值明显降低，即缺血皮质区mGluR5 mRNA胞浆内表达明显升高，比较差异均有统计学意义（P<0.01）。mGluR5 mRNA胞浆内表达6 h达到高峰（F=5.328，P<0.01），3 d后表达开始下降（P<0.01），14 d基本降至正常对照水平（P>0.05）。手术组各时间点缺血皮质区mGluR5 mRNA胞浆内表达与手术组缺血6 h比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 组织形态学改变 光镜下假手术组未表现神经元形态异常；手术组皮质部分神经元结构表现出坏死样改变，包括细胞核浓缩、胞浆红染加深、细胞结构不清、呈梭形或三角形改变，异常结构呈小灶分布，见图1～4。

3 讨论

GluR按与配体结合后的效应的不同分为两类：一类是iGluR，包括NMDA受体、AMPA受体和KA受体，另一类是mGluR[5]。mGluR5是1992年国外研究者由mGluR1做探针从鼠脑的cDNA文库中首次分离[6-7]。mGluR5在脑内分布广泛，正常情况下mGluR5的表达在成年大鼠脑内皮质浅层及多个核团内是广泛存在的，研究表明人类与大鼠的mGluR5氨基酸序列有94.5%的同源性，推测mGluR5 mRNA高表达区也是纹状体、海马及大脑皮质[8-9]。

有研究发现手术组mGluR5 mRNA表达多于假手术组及对照组，脑组织病理检测也证实手术组脑细胞明显水肿和神经元坏死的病理形态学改变[10]。因此，本文推测mGluR5是起神经损伤作用的，在脑缺血性损害时，Glu介质大量释放，激活mGluR5而引起脑细胞一系列生化反应及病理变化。原位杂交实验显示大鼠缺血后大脑皮层mGluR5 mRNA表达在缺血后1 h即有明显增加，到缺血后6 h达到高峰，3 d表达开始下降，14 d基本降至正常对照组水平。推测其实验显示变化过程主要与钙离子超载有很大关系。而正常对照组与各假手术对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），说明单纯的手术操作对mGluR5 mRNA表达无明显影响。根据上述研究，可选择性地将mGluR5作为治疗脑缺血神经损伤的靶点，为脑梗死的防治提供了新的思路，具有一定的临床应用前景[11-12]。endprint

参考文献

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（收稿日期：2014-01-20） （本文编辑：黄新珍）endprint

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