通过鲜牛奶滞留时间的相关参数判断案发时间的研究

蔡东华李 蕾

（1 苏州市公安局 江苏 苏州 215000；2 苏州市公安局相城分局 江苏 苏州 215000）

通过鲜牛奶滞留时间的相关参数判断案发时间的研究

蔡东华1李 蕾2

（1 苏州市公安局 江苏 苏州 215000；2 苏州市公安局相城分局 江苏 苏州 215000）

采用紫外分光光度法，检测牛奶中的细胞含量、糖含量、蛋白质含量的变化，同时利用pH试纸测量酸碱变化，得到了4组数据和变化曲线。

牛奶 紫外分光光度仪 案发时间

牛奶变质的传统检测一般是用生物、化学的原理来建立一些指标，如标准平皿菌落计数法、大肠杆菌群乳糖胆盐发酵法等。这些方法技术成熟，容易做出量化的指标，但存在操作烦琐、费时的缺点。近年来，国内外检测牛奶都开始大范围的使用物理仪器，优点是快速、精确。但目前的研究都仅限于单方面的参数，如R.Tsenkova等人通过近红外光谱来检测牛奶中的体细胞数；朱亚菲等人利用旋光法测定牛奶中糖的含量。本文在总结前人对牛奶中各种物质检测和分析所用方法的基础上发现：利用紫外分光光度仪可以同时对牛奶中的细胞含量、糖含量、蛋白质含量的变化进行跟踪测量。此方法快速、准确、成本较低，极其适合公安工作。

1 实验材料与方法

1.1 样品

用蒙牛特仑苏盒装纯牛奶进行实验。选取牛奶全部为同一批次。选择日期为实验前1天生产的新鲜牛奶。实验前1天，准备22个烧杯，7天实验，每天3个样本，共21个烧杯都倒上40mL的牛奶，编号为1.1，1.2，1.3，……7.1，7.2，7.3。第22个烧杯为空白样本，倒满，编号为0。为保证实验条件的一致，将1-21号烧杯至于恒温恒湿箱内，模仿夏日条件，设温度为30℃，湿度为80℃。

1.2 主要仪器与试剂

仪器：上海尤尼柯仪器有限公司产的UV-2600型紫外可见分光光度仪；上海跃进医疗器械厂产的LRHS-250B恒温恒湿培养箱；上海康华生化仪器制造有限公司 HS-6001超级恒温水浴箱；德国eppendorf公司产的5804R离心机。

试剂：磷酸、无菌水、100ug/mL的酪氨酸溶液、0.9%的NaCl溶液、DNS试剂、1mg/mL葡萄糖标准液、酒精。

1.3 方法

1.3.1 波长的选择

本实验选用紫外分光光度计进行测量，测量时选用的吸收波长关乎着实验结果是否准确，因此，必须先用样品牛奶进行吸收波长的预实验，即当牛奶中需要测量的物质出现最强吸收峰时，峰值对应的波长便为最佳波长。细胞、糖、蛋白质的最佳波长分别为600nm，540nm，280nm。

1.3.2 测定牛奶中的细胞含量

设定波长为600nm，第1天在样本0和样本1.1，1.2，1.3（第2天重复第1天操作，在出现固体的时候取上清液）中分别取2mL牛奶注入比色皿中。用空白样调零，再依次放入1.1，1.2，1.3号样本，测量，记录OD值，并通过公式1/108=OD/X（X为细胞含量）来计算该样本中的细胞含量。3份样本分别测完后取平均值，并绘制变化曲线。

1.3.3 测定牛奶中的糖含量

第一步制作葡萄糖标准曲线。取离心管，按表1配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1 葡萄糖标准液配制

将各离心管摇匀，在沸水浴中加热5min后冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至2.5mL。设紫波长为540nm，用0号管调零点，测出1-6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，得出线性回归方程，即为标准曲线，如图1。

第二步牛奶样品中还原糖的提取。样品组按磷酸0.25mL，无菌水 1.05mL，待测样品 （牛奶）0.2mL，37℃水浴30min，DNS2.5mL，沸水浴10min，流水冷却3min，离心1000rpm，4℃，10min，取上清液2mL测定OD值（540nm）的顺序添加和操作。空白组按磷酸0.25mL，无菌水1.05mL，空白样品（蒸馏水）0.2mL，加2.5mLDNS，37℃水浴30min，沸水浴 10min，流水冷却 3min，离心 1000rpm，4℃，10min，取上清液2mL测定OD值（540nm）的顺序添加和操作。

第三步测量。用空白组调零后，在540nm的波长下测定1.1，1.2，1.3号样本的OD值，查对标准曲线并利用公式：

便可求出牛奶中的总糖含量，以时间为横坐标，总糖含量的变化为纵坐标绘制牛奶中糖含量的变化曲线。

1.3.4 测定牛奶中的蛋白质含量

第一步用酪蛋白配置蛋白质标准溶液。取试管，按表2配成不同葡萄糖含量的反应液。

表2 蛋白质标准液配制

将各试管摇匀。设波长为280nm，用0号管调零点，测出1-5号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，得出线性回归方程，即为标准曲线，如图2。

图1 葡萄糖标准曲线

图2 蛋白质标准曲线

第二步，配取待测液。将每份牛奶稀释10倍，取稀释后的待检液2mL，用0.9%的NaCl溶液定容至10mL，在280nm的波长下测定1.1，1.2，1.3号样本的OD值。取平均值，查对标准曲线并利用公式：

来计算牛奶中的实际蛋白质浓度，并以时间为横坐标，牛奶中实际蛋白质浓度为纵坐标绘制蛋白含量的变化曲线。

1.3.5 测定牛奶的酸碱变化

利用pH试纸，试纸保持干燥，放入溶液半分钟后取出与标准样板比较。得出溶液的pH值，记录并绘制变化曲线。

2 结果

实验结果，如图4-图7（单位：×107个/mL）。

图3 牛奶中细胞含量随时间变化曲线图

图4 牛奶中糖含量随时间变化曲线图

图5 牛奶中蛋白含量随时间变化曲线图

图6 牛奶pH值随时间变化的曲线图

从图中可以看出4项参数的变化趋势。牛奶中的细胞含量会随着时间的推移先上升，经历过一段平稳期后再逐渐下降。牛奶中的糖含量和蛋白质含量都会随着时间逐渐下降。牛奶的pH值会随着时间的推移越来越小，即牛奶会越来越酸，但下降到一定程度趋于平稳后，就不再下降。

3 讨论

细胞含量出现以上变化是因为牛奶中富含微生物繁殖所需的营养，微生物很容易繁殖。鲜牛奶中一旦有细菌开始滋生繁殖，其中的各种养分在这些微生物的作用下就会发生一系列变化。而细菌本身的繁殖变化就具有一定的规律，分为4个阶段，第1阶段为迟缓期。即细菌的适应期，所以繁殖较少。第2阶段为对数期。此期活菌数直线上升，可因不同的条件持续几小时至几天不等。第3阶段为稳定期。该期的生长菌群总数处于平坦阶段。但由于营养物质消耗、毒性产物积累，pH下降等不利因素，细菌繁殖速度渐趋下降。第4阶段为衰亡期。随着稳定期的发展，细菌繁殖越来越慢直至逐渐死亡。可见牛奶中细胞的变化规律与此基本相符。

糖含量出现以上变化是因为牛奶中的绝大部分细菌都含有能分解乳糖的酶。例如：乳糖杆菌中含有乳糖酶，可将乳糖分解为D-(+)-葡萄糖和D-(+)-半乳糖；这些单糖随即又被其他的酶转变为葡萄糖-6-磷酸酯，后者又依次被其他8种酶、经过10个反应转化为丙酮酸。所以随着时间的增长，牛奶中的糖含量会越来越少。

蛋白质含量出现以上变化是因为蛋白质的微生物降解反应。蛋白质被牛奶中细菌的酶分解为各种氨基酸的混合物，这些氨基酸又进一步被分解为各种有机酸、醛、醇和其他无机小分子物质。反应的主要机理是各种氨基酸先被氧化脱氨再脱羧。所以随着时间的增长，牛奶中的蛋白含量会越来越少。

pH值的变化主要是因为乳酸的产生。随着乳酸的生成，牛奶的pH不断下降，虽然细菌的繁殖使牛奶的pH降低且出现凝结现象，但牛奶中的细菌并不喜欢酸性环境。低pH的酸性环境抑制了细菌的繁殖，因此下降到一定程度时就不会再下降，也不会再产生乳酸了。

本方法优点，利用检测仪器，能检测到不同温度，不同湿度，不同品牌的牛奶中这4组数据的变化，并以此可以建立一个完备的数据库。一旦现场发现开封牛奶，经过对其中4组参数的测量，再与数据库中的数据进行对比，就能作为一个很好的辅助手段帮助我们反推牛奶的开封时间，进而在缺少能准确判断案发时间条件的情况下，帮助我们判断案发时间。该方法简便、客观、微量、准确。

但是，该种方法也具有一定的局限，首先，4组数据需要一起运用，单独一组可能会出现误差。其次，判断的时间有限，时间过长后牛奶中的营养物质消耗殆尽，牛奶中的这4项指标都会失去参考价值；再次，细菌种群对牛奶的影响；最后，要建立成一个完备的数据库还需要大量的实验。

[1]刘毅萍，何建平.平皿菌落计数法检测便携式紫外线灭菌灯的灭菌效果[J].安徽医药，2005，(7).

[2]张勇，刘衡川，周海涛，等.冷冻损伤大肠菌群在乳糖胆盐发酵培养基生长状况[J].中国热带医学，2009，(6).

[3]R.Tsenkova，S.Atanassova，K.Itoh，etal Near infrared spectroscopy for biomonitoring： Cow milk compositionmeasurementinaspectralregionfrom1，100to 2，400nanometersl[J].AnimalScienceJournal.2000(4)，23(2).

[4]朱亚菲，吴俊林.用旋光法测定牛奶中糖的含量[J].陕西师范大学学报 （自然科学版）.2006，34(6).

[5]汤伟，王明伟，董文宾，等.牛奶主要营养成分的数学模型[J].陕西科技大学学报，2005，(23).

[6]陈士运，沈旭，苗立中，等.应用紫外分光光度法进行禽多杀性巴氏杆菌(C48-1)细菌计数的研究[J].山东畜牧兽医，2009，(5).

[7]夏金婵，苗雨晨，宋纯鹏，等.紫外分光光度技术测定植物细胞中H2O2的含量[J].四川大学学报(自然科学版)，2005，42(6).

[8]杨贵明，蒋爱华，薛秋生.用DNS光度法测定还原糖的条件研究[J].安徽农业科学，2006，34(14).

[9]王俊丽，聂国兴，李素贞，等.DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定[J].河南农业科学，2010，(4).

[10]曹红翠.紫外分光光度法测定蛋白质的含量[J].广东化工，2007，34(8).

[11]高莉萍，盛凤仙，浦奕奕，等.紫外分光光度法快速测定人纤维蛋白原制品中蛋白质含量[J].上海预防医学，2012，24(1).

[12]张华，夏占强，叶萍，等.紫外分光光度法快速测定纤维蛋白粘合剂中蛋白质含量[J].亚太传统医药，2012，8(8).

[13]田志梅，张永顺.紫外分光光度法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量[J].中国卫生检验杂志，2008，18(2).

（责任编辑：于 萍）

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2013-12-1

蔡东华（1989-），男，江苏盐城人，苏州市公安局民警，学士。