“祛风通窍方”对血管性痴呆大鼠海马线粒体COX活性及COXⅡmRNA表达的影响

白雪 唐红梅 叶丽莎 杨云芳 张德绸 罗刚

（泸州医学院附属中医医院，四川泸州 646000）

“祛风通窍方”对血管性痴呆大鼠海马线粒体COX活性及COXⅡmRNA表达的影响

白雪 唐红梅 叶丽莎 杨云芳 张德绸 罗刚

（泸州医学院附属中医医院，四川泸州 646000）

目的：观察祛风通窍方对血管性痴呆（Vascu1ar dementia，VD）大鼠海马线粒体细胞色素氧化酶（COX）及细胞色素氧化酶Ⅱ亚型（COXⅡ）mRNA表达的影响，探讨祛风通窍方对VD可能的保护机制。方法：大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组和祛风通窍方高、中、低剂量组。除假手术组外，其余各组大鼠采用经典的永久性结扎双侧颈总动脉法制备VD模型。假手术组、模型组用等体积蒸馏水灌胃，各给药组予相应药物灌胃，连续30d。ELISA法检测海马线粒体COX活性；RT-PCR法检测COXⅡmRNA表达水平。结果：与假手术组比较，其余各组大鼠COX活性明显降低，COXⅡmRNA表达明显降低；与模型组比较，尼莫地平组和祛风通窍方高、中剂量组COX活性明显升高，COXⅡmRNA表达明显增加。结论：祛风通窍方对VD大鼠线粒体功能具有一定的保护作用，可能与其改善VD大鼠线粒体COX活性，增加COXⅡmRNA的表达有关。

血管性痴呆 祛风通窍方 海马线粒体 COX COXⅡ 实验研究

血管性痴呆（Vascu1ar dementia，VD）是在各种脑血管疾病基础上，因脑组织慢性缺血、缺氧而导致的以记忆、认知功能障碍为特征的痴呆综合征。本研究采用经典的永久性结扎双侧颈总动脉（2-VO）法造模[1-3]，在前期研究基础上，进一步观察“祛风通窍方”对VD大鼠海马组织线粒体细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase，COX）活性及细胞色素C氧化酶Ⅱ亚型（cytochrome C oxidase subunitⅡ，COXⅡ）mRNA表达的影响，探讨“祛风通窍方”对VD的可能作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物健康雄性SD大鼠48只，普通级，12～24月龄，体重（350±20）g，由泸州医学院实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：2010-200。

1.2 药物与试剂“祛风通窍方”由麻黄10g、葛根30g、水蛭5g、地龙10g、全蝎5g、灵芝10g、石菖蒲20g组成。购入的中药由泸州医学院附属中医医院制剂室制备成浓缩液，每1mL浓缩液相当于原生中药3g的含量。尼莫地平片由山西亚宝药业生产。ELISA法试剂盒、RT-PCR试剂盒、天根RNA提取试剂盒购自南京建成生物科技有限公司。内参GAPD H引物（RT-PCR试剂盒内带）：上游5'-ACCACAGTCCAT GCCATCAC-3’，下游5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，产物长度400bp；COXⅡ引物（上海生工生物技术服务有限公司合成）：上游5'-ACGCCACATCACCAATC-3’，下游5’-GCGAAGTTCACCTAGTT-3’，产物长度371bp。

2 实验方法

2.1 分组与造模大鼠适应性喂养1周，随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组和祛风通窍方高、中、低剂量组，每组8只。VD模型采用永久性结扎双侧颈总动脉法制备，假手术组只分离双侧颈总动脉但不结扎。造模后1月开始给药，给药剂量按照人与动物之间用药剂量换算得到祛风通窍方高、中、低剂量组生药量分别为26.8、13.4、6.7g/（kg·d）；尼莫地平组给予尼莫地平6.25mg/（kg·d），模型组、假手术组予等体积蒸馏水，各组均连续灌胃30d。

2.2 指标检测

2.2.1 海马组织线粒体COX活性测定末次给药后，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉，断头取脑组织，剥离海马，制备海马组织匀浆，4℃、3500r/min离心15min，取上清液，4℃、12000r/min离心15min获得线粒体，超声细胞破碎仪破碎线粒体，根据说明书ABC-ELISA法试剂盒说明书测定COX活性。

2.2.2 RT-PCR法检测海马组织线粒体COXⅡmRNA表达

运用RNA提取试剂盒提取海马组织线粒体的RNA，进行线粒体RNA浓度测定、纯度测定后逆转录合成cDNA。20μL反应体系：5xRT Buffer4μL，dNTP Mixture（each 10mmo1/L）2μL，Super-RI 0.5μL，RT-Enhaner 0.5μL，Random Primer 1μL，Tota1 RNA 11μL，Rever Tra Ace 1μL；反应条件：30℃10min—42℃35min—99℃5min—4℃5min，反应结束后得到cDNA。PCR反应体系20μL：RT反应后原液2μL，RNase Free H2O 6μL，序列特异的上游引物（10pmo1/μL）1μL，序列特异的下游引物（10pmo1/μL）1μL，12xTaqPCR MasterMix 10μL；PCR扩增条件：94℃变性30s，50℃解链30s，72℃延伸1min，反应30个循环，最后72℃延伸5min。PCR反应结束后，取6μL产物，加6μL溴酚蓝混匀，2%琼脂糖凝胶上样，然后电泳，当电泳迁至凝胶全长的2/3处时终止电泳，取出凝胶，将凝胶置于凝胶成像仪内拍照，用Quantity one软件分别计算出各组COXⅡ-mRNA和GAPDH强度的比值，检测大鼠海马组织线粒体中COXⅡ-mRNA的相对含量。

2.3 统计学方法数据采用SPSS 17.0软件进行分析，计量统计用（±s）描述，两两比较用LSD-t法，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠海马组织线粒体COX活性的比较与假手术组比较，模型组、尼莫地平组和祛风通窍方高、中、低剂量组大鼠海马组织线粒体COX活性明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，尼莫地平组和祛风通窍方高、中剂量组COX活性明显升高（P＜0.05），祛风通窍方低剂量组COX活性无显著性差异；与尼莫地平组比较，祛风通窍方高、中剂量组COX活性明显增高，低剂量组COX活性明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与祛风通窍方高剂量组比较，中、低剂量组COX活性明显降低（P＜0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠海马组织线粒体COX活性比较（±s）

表1 各组大鼠海马组织线粒体COX活性比较（±s）

注：*与假手术组比较，P＜0.05；#与模型组比较，P＜0.05；★与尼莫地平组比较，P＜0.05；◆与祛风通窍方高剂量组比较，P＜0.05。

组别例数剂量假手术组COX（U/mg prot）8—0.5965±0.005#◆8—尼莫地平组86.25mg/（kg·d）0.4220±0.0047*#◆祛风通窍方高剂量组826.8g/（kg·d）0.5397±0.0081*#★祛风通窍方中剂量组813.4g/（kg·d）0.4856±0.0081*#★◆祛风通窍方低剂量组86.7g/（kg·d）0.2918±0.0074*★◆模型组0.2909±0.0082*

3.2 各组大鼠海马组织线粒体内COXⅡmRNA表达情况

与假手术组比较，模型组、尼莫地平组和祛风通窍方高、中、低剂量组相对灰度值明显偏低（P＜0.05）；与模型组比较，祛风通窍方高、中剂量组和尼莫地平组相对灰度值均有明显升高（P＜0.05）；与尼莫地平组比较，祛风通窍方高、中剂量组相对灰度值升高，低剂量组相对灰度值降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与祛风通窍方高剂量组比较，中、低剂量组灰度值明显降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠海马组织线粒体内COXⅡmRNA比较（±s）

表2 各组大鼠海马组织线粒体内COXⅡmRNA比较（±s）

注：*与假手术组比较，P＜0.05；#与模型组比较，P＜0.05；★与尼莫地平组比较，P＜0.05；◆与祛风通窍方高剂量组比较，P＜0.05。

组别例数剂量假手术组相对灰度值8—0.5274±0.0365#8—尼莫地平组86.25mg/（kg·d）0.2341±0.0179*#◆祛风通窍方高剂量组826.8g/（kg·d）0.4091±0.0559*#★祛风通窍方中剂量组813.4g/（kg·d）0.3196±0.0393*#★◆祛风通窍方低剂量组86.7g/（kg·d）0.1651±0.1013*★◆模型组0.1627±0.0971*

4 讨论

目前认为VD的发生、发展与脑卒中有密切关系，与脑卒中的其他危险因素也相关，VD的发病机制认为有氧化应激损伤、兴奋性氨基酸毒性、胆碱能受损、炎症反应、程序性细胞凋亡等。VD虽是多种因素参与的复杂的慢性的病理过程，其线粒体（mitochondrion，MIT）氧化损伤起着关键性的作用。COX存在于MIT内膜上，其参与MIT有氧呼吸及能量产生。在脑组织慢性缺血缺氧时，MIT功能障碍，生成过多氧自由基（Oxygen free radica1s，OFR），能量生成障碍，MIT受损，神经元退化、变性、坏死等，使得VD的病情进一步加重。

COX存在于线粒体内膜上，是一种由nDNA和mtDNA复合的跨膜蛋白，是呼吸链中电子传递链的关键酶，转移电子到氧气分子（O2）并把O2还原为水。COX与有氧代谢及呼吸密切相关，其活性不仅受线粒体周围化学环境的影响，更受遗传物质COXⅡ的影响。COX在参与有氧代谢时将线粒体氧化磷酸化（Oxidative phosphory1ation，OXPHOS）过程中的能量转变为三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），为神经细胞提供能量。当大脑长期慢性缺血缺氧后，脑组织内OFR生成增多，线粒体成为OFR攻击的靶点，线粒体功能受损，由mtDNA编码的COXⅡ表达受到抑制[7]，进而使得COX活性下降，线粒体的OXPHOS过程发生障碍，ATP产生也发生障碍，神经元细胞受损，发生迟发性的变性、坏死等，进而影响学习、记忆功能。当COX活性下降后，O2不能被还原，生成过多的OFR，使得线粒体编码基因发生紊乱，线粒体编码的亚型基因COXⅡ表达受到抑制，形成恶性循环，最终线粒体形态及功能受损。实验研究发现，缺血缺氧时，OFR的增加对膜脂、蛋白质、DNA及其他大分子物质造成损伤，抑制COXⅡ的转录和翻译，使COXⅡ表达下降[8]。

VD的防治多为危险因素的干预，治疗原发性脑血管病；当出现认知功能障碍时，常给予药物改善。常用的有胆碱酯酶抑制剂、改善脑循环的药物、促进脑细胞代谢的药物、神经生长因子、自由基清除剂、高压氧治疗等。其中改善微循环药中非二氢吡啶类Ca2+拮抗剂尼莫地平是迄今选择性扩张脑血管最强的Ca2+通道阻滞剂，易透过血脑屏障，临床广泛用于VD的治疗[4-6]。

本研究发现，模型组COX的活性及COXⅡ的mRNA表达下降，尼莫地平组和祛风通窍方高、中剂量组COX活性、COXⅡmRNA表达较模型组明显升高；与尼莫地平组比较，祛风通窍方高、中剂量组COX活性、COXⅡmRNA表达明显升高。

本研究基于文献提出五脏六腑皆有玄府，脑亦不例外，认为脑之玄府不通乃为VD发病根本[9-10]。治疗原则为“开通玄府，滋补促智”。因“高巅之上，唯风药易到”，故组方中重用风药，配伍滋补药、虫类药。祛风通窍方中麻黄、葛根为君，通玄府，散精气；水蛭、地龙、全蝎“血肉有情”之品为臣，可搜风通络，通玄府；佐灵芝益气扶正，滋补五脏；石菖蒲为使，开窍宁神，取其清轻流动之性，引药直达脑窍。诸药合用，共奏祛风通窍、活血化瘀、滋补促智的功效。现代药理研究发现，麻黄对自氧化有较强的抑制作用，能清除氧自由基，起到抗氧化作用；葛根具有清除氧自由基抗脂质过氧化、抗血小板聚集、抗肿瘤等多种作用；水蛭可降低脑细胞的凋亡，减少神经元的不可逆损伤；地龙具有抗血栓、增强免疫、抗氧化等作用；全蝎抗血栓、抗氧化；灵芝抗氧化，提高记忆力；石菖蒲清除氧自由基，抑制神经元凋亡。本实验说明祛风通窍方在一定程度上减弱了OFR对线粒体编码的COXⅡ基因表达的影响，使COX活性改善，发挥抗氧化的作用，从而对线粒体起着保护功能，此作用存在一定的量效关系。

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R749.130.5

A

1672-397X（2014）05-0075-03

白雪（1972-），女，医学硕士，主任中医师，研究方向：中西医结合脑病的基础与临床研究。bx7246@163. com

2014-01-20

编辑：吴宁

四川省教育厅重点项目（11ZA152）；泸州市科技局项目（2012-S-38）