牛精液冷冻保护剂研究进展

贾永宏，朱庆超，杨海涛，武致存，高 璞，李 梅，胡建宏*

(1.陕西省家畜改良站，陕西 泾阳 713702；2.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；3.陕西省白水县家畜改良站，陕西 白水 715600；4.陕西省白水县动物疫病控制预防中心，陕西 白水 715600)

牛精液冷冻保护剂研究进展

贾永宏1，朱庆超2，杨海涛1，武致存3，高 璞4，李 梅3，胡建宏2*

(1.陕西省家畜改良站，陕西 泾阳 713702；2.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；3.陕西省白水县家畜改良站，陕西 白水 715600；4.陕西省白水县动物疫病控制预防中心，陕西 白水 715600)

牛的人工授精技术是目前应用最为广泛的动物繁殖技术之一，对牛的遗传改良做出了巨大贡献。但是，在冷冻-解冻过程中仍然有大约40%～50%的精子失去活性，限制良种公牛种用性能的发挥。论文在分析精子冷冻保存原理的基础上，阐述了渗透性、非渗透性冷冻保护剂以及低密度脂蛋白对牛精子的冷冻保护作用，以期为开发新型冷冻保护剂的研究提供一定参考，进一步提升牛冷冻精液的质量。

牛；精液冷冻保护剂；冷冻保存原理

1951年，世界上第一头通过冷冻精液进行人工授精牛犊的诞生，开创了牛精液冷冻技术在生产中推广应用的先河[1]。我国于1958 年首次进行精液冷冻技术研究，并取得成功[2]。20世纪 80年代，我国开始从国外引进先进的设备和技术用于冷冻精液的生产，到90年代时冷冻精液逐步由颗粒型转向细管型[3]。目前利用冷冻精液人工授精技术在奶牛繁殖与改良方面应用最为普及，几乎达到100%[4]。虽然如此，但精液冷冻-解冻后仍有大约50%的精子失去活性，严重降低了良种公牛的利用率。本文阐述了关于牛精液冷冻的基本原理以及冷冻保护剂的研究进展，以期为进一步提升牛冷冻精液质量提供参考。

1 精子冷冻保存的原理

精子是一种生殖细胞，当外界环境温度发生变化时，精子本身的活动力和代谢能力也会发生变化。将采集的新鲜精液经过品质检查后，利用液态氮(-196 ℃)或固态二氧化碳(干冰-79 ℃)等作为冷源，将精子保存在超低温环境下，精子的代谢活动几乎完全受到抑制并可长期保存，也就是精子的生命在静止状态下长时间保存。当温度回升解冻后，精子又能恢复原有活力，并且具有受精的能力。目前，关于细胞冷冻保存的机理尚不完全清楚，代表性的假说主要有以下五种。

1.1 细胞冷冻损伤的两因素假说

1972年，Mazur[5]对仓鼠组织细胞进行了低温保存研究，并提出了细胞冷冻损伤的两因素假说，认为造成细胞冷冻损伤的独立因素有两个：一是过快冷却导致的细胞内冰晶的形成，冰晶通过破坏精子细胞膜和细胞内部结构以及渗透压升高，从而对细胞造成损害。冷却速度越快，所造成的损伤越大；二是过慢冷却导致的溶质损伤/溶液损伤，这是由于细胞过长时间暴露在高浓度溶液中所致。在高浓度溶液中，细胞脱水收缩，引起细胞内原生质浓度升高，细胞器也随之发生变化，并且在渗透收缩过程中，细胞膜压力的增加也导致了细胞损伤。一般冷却速度越慢时，该损伤就越大。当然，两因素理论中的过快冷却、过慢冷却是相对具体细胞而言。

对于冷冻保存来说，在临界温度范围内的冷却/冻结速率(5～50 ℃/h)相当重要，决定精子能否与细胞外环境保持平衡或随胞内冰晶形成可能性的逐步增加变成过冷状态。在缓慢冷却过程中，精子会一直脱水直至达到在细胞内外的渗透平衡点，即细胞脱水会最大化。而过多地提高冷却速率，脱水不足会导致胞内冰晶成核。然而，如果冷却速度在所需值(50～100 ℃/h)，即可以减少过度的细胞内脱水，降低过度的细胞内溶质浓度和减少细胞皱缩[5-6]。

1.2 电解质失衡假说

20世纪50年代，Lovelock等[7]研究认为，动物精子对电解质溶液的浓度具有一定的耐受范围，而一旦超过该范围时就会损伤精子，甚至导致精子的死亡。当环境温度降低时，细胞间隙中的水分会形成细小冰晶，由于细胞脱水，细胞间隙液体所含的电解质的浓度相应升高，渗透压增大，从而导致细胞内水分外渗，细胞脱水皱缩。随着环境温度的继续降低，胞内剩余水分结冰，致使胞内的电解质的浓度也快速升高，当超过细胞的耐受力范围浓度时，就会对细胞产生毒害作用，包括酶活动紊乱、细胞器受损、蛋白质变性、pH改变等，细胞最终死亡。该假说与Mazur提出的两因素假说--过慢冷却导致溶质损伤的理论有些近似。当对精子进行低温保存时，在稀释液内加入水溶性、通透性且对细胞无毒害作用的中性物质时，可以抑制冷冻过程中冰晶的形成，从而减轻冷冻保存过程对精子所造成的损害。

1.3 物理屏障假说

物理屏障假说认为，细胞内水分子会形成物理屏障保护细胞内的蛋白质免受伤害，但是冷冻会导致细胞内脱水，蛋白质由于失去水分子的保护而使其结构发生变化，细胞受到低温损伤。1962年，研究者提出了硫氢基假说，认为由于温度的降低导致细胞膜的物理屏障发生变化，从而引起了细胞的低温损伤[8]。细胞的抗冻能力取决于细胞内蛋白质硫氢基(-SH)的含量，但在冷冻条件下，蛋白质会发生脱水并相互靠拢，当靠拢到一定程度时，-SH基会发生氧化作用，生成-SS-键或-S-S-键，导致膜蛋白分子构象发生改变而凝聚。解冻后，细胞内蛋白质重新吸收水分，肽链松散，氢键断裂，但由于双硫键保持不变，导致细胞蛋白质的空间构型难以复原。同时，由于细胞内聚力比膜蛋白小，在细胞结冰时产生张力，双分子的脂类层因冷冻而较易发生破裂，最终导致细胞膜的选择透过性发生改变，胞内物质外渗，造成细胞死亡。

1.4 结构水假说

1965年，Karrow等[9]提出结构水假说，认为细胞内的水由自由水和束缚水两种类型所组成，束缚水是那些与蛋白质发生水合作用后包围在蛋白质表面且不易自由流动的水分，对于维持细胞蛋白质的结构与功能具有重要作用。在细胞冷冻时，胞内的自由水首先冻结成冰，随着冷冻的持续进行，导致胞内自由水比例降低，胞内的束缚水开始析出且冻结成冰，导致包围在蛋白质表面的束缚水减少甚至消失，失去束缚水保护的蛋白质因析出凝聚而发生变性，造成细胞损伤甚至死亡。

1.5 生物膜伤害假说

该假说由郑斯涌[8]提出，他认为造成细胞冷冻损伤的因素主要有两个：(1)冷冻-解冻过程中，细胞内及细胞间的结冰与融化对细胞造成了损伤；(2)低温冷冻时冷冻保护剂对细胞的毒害作用。在这两个因素的作用下，导致细胞的结构和功能发生变化，尤其是对细胞膜、核膜、线粒体膜等生物膜的损害很大，导致膜蛋白发生变性，膜的通透性改变，稳定性下降；线粒体膜遭受破坏，影响能量的产生。生物膜的损伤使得细胞内物质的合成能力和酶活性显著降低。当冷冻结束后，大量水分会渗入细胞，导致细胞内外充水，形成缺氧微环境，最终导致细胞的各种功能下降，细胞死亡。

2 精液冷冻保护剂

冷冻保护剂根据其保护原理可分为非渗透性和渗透性两大类。非渗透性保护剂难以渗透到精子细胞内部，但可以结合溶液中的水分子，使溶液中的自由水含量降低。同时使细胞外溶液的浓度增高，细胞内水分渗出，细胞内溶液的浓度也升高，从而减少细胞内外冰晶的形成，从而保护细胞免遭损伤的一类保护剂。如：葡萄糖、蔗糖、聚乙二醇、白蛋白等[10]。渗透性保护剂可以渗透到细胞内部，使细胞内外溶液的浓度升高，胞内外未结冰溶液中电解质的浓度降低，保护精子细胞避免高浓度电解质的损害。另外，细胞内的水分也不过渡向外渗出，从而避免细胞因过分脱水而皱缩。例如甘油、二甲基亚砜、甲醇、酰胺类、乙二醇等[10]。

2.1 渗透性冷冻保护剂对精子的保护作用

二甲基亚砜 (DMSO) 和甘油是目前比较常用的抗冻保护剂，但多数报道认为甘油的保护效果更好，所以甘油的应用更为广泛[11]。甘油是一个拥有多个羟基、氢键具有结合水的能力的渗透性保护剂，能够渗透生物膜。在精子冷冻保存过程中，甘油发生作用是通过替代细胞内的水分来维持细胞体积、离子间的交互作用和降低水的冰点，以及随后的降低电解质浓度[12-13]。DMSO是一种快速渗透性的冷冻保护剂，比甘油的分子量低，但渗透性比甘油要高，且DMSO可以抑制羟基自由基的不良影响。但是，DMSO本身具有一定的毒性，有时会对细胞产生致死效应，这种效应大部分归因于它的毒性而非渗透性。

2.2 非渗透性保护剂对牛精子的保护作用

精液病菌的感染与疾病的传播可能由动物类冷冻保护剂引起，因而科学家近年来一直在不断寻找新的冷冻保护剂，以提高其保护效果并减少疾病的传播。Woelders等[6]报道，海藻糖和蔗糖均可在冷冻环境下保护精子免受伤害，但蔗糖的保护效果更明显；王锋等[14]通过在稀释液中添加乙二醇或丙二醇，使精子的顶体完整率得到显著提高，但精子活力与存活时间无明显变化；Bilodeau等[15]研究表明，在EYTG中添加各种硫醇，可以有效抑制EYTG对精子的毒害作用；张文举等[16]报道，还原型谷胱甘肽可以显著提高精子活力和顶体完整率，改善母牛情期受胎率；Hu等[17]研究表明，稀释液中添加维生素E可以降低脂质的过氧化作用，提高冷冻-解冻后的牛精液品质；Fabbrocini等[18]及Bilodeau等[19]报道，在精液稀释液中加入丙酮酸盐可以提高抗氧化性能，改善地中海水牛精子的冻后质量。Bucak等[20]研究认为，抗氧化剂(蛋氨酸、肌醇和肉碱)可以保护精子DNA免受冷冻伤害，维持其完整性；Verberckmoes等[21]认为，附睾液对于提高精子活力有很大帮助。Tuncer等[22]研究认为，半胱氨酸和谷胱甘肽也能够降低冷冻对DNA的损害；Ansari等[23]在稀释液中添加丁羟甲苯，发现能够显著提高牛精子的冻后质量；Hu等[24-25]研究发现，稀释液中添加维生素B12可显著提高牛精子活力、顶体完整率和质膜完整率。另外，稀释液中添加维生素还可有效减少由冷冻-解冻造成的氧化应激，维持精子的运动能力[26-27]。

3 低密度脂蛋白对牛精子的保护作用

低密度脂蛋白(LDL)和磷脂是卵黄中对精子起保护作用的主要有效成分。卵黄中的固体物质由LDL和其它物质组成，其中，低密度脂蛋白大约占2/3。LDL是一种甘油三酸脂和胆固醇内核被磷脂和蛋白外膜包围的球状分子，包含83%～89%的脂质和11%～17%的蛋白质[28]。Lamia等[29]研究证明，用LDL完全替代蛋黄后，提高了牛精子冻后活力。但是，卵黄中存在一些有害成分，这些成分不利于LDL在超低温下对牛精子的冷冻保护。卵黄中的小颗粒物质对精子冻后活率产生一定的有害作用[30]，卵黄中的高密度脂蛋白可诱导精子膜上的胆固醇外流，导致精子提前获能[31]。关于LDL保护精子的原理，Bergeron等[32]认为，LDL与精清蛋白质结合后可以减少脂质含量，还可防止精子质膜的内部损伤；LDL中的脂质能够与精子膜结合，防止细胞膜的完整性受到破坏，从而达到保护精子的作用。

虽然牛冷冻精液的研究相对比较成功，但我国牛冷冻精液的研究水平与国外相比仍然存在较大差距。精液冷冻技术是现代动物繁殖技术的基础，对于提高优良公牛的利用率，推动牛品种改良步伐，保护优良种牛资源以及大力发展养牛业，促进中国畜牧业的发展等有巨大作用。因此，今后应该在冷冻-解冻过程中精子细胞内外蛋白磷酸化水平上继续探索，研究低温信号在精子内的传递与调控过程，揭示精子冷冻损伤的分子机制，进一步提高牛冷冻精液的质量。

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ResearchProgressinCryoprotectantofBullSemenCryopreservation

JIA Yong-hong1,ZHU Qing-chao2,YANG Hai-tao1,WU Zhi-cun3,GAO Pu3,LI Mei3,HU Jian-hong2*

(1.DomesticAnimalImprovingStation,Jingyang,Shaanxi713702,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,YanglingShaanxi712100,China;3.DomesticAnimalImprovingStationofBaishuiCounty，BaishuiShaanxi715600,China;4.AnimalDiseasesControl&PreventionCentreofBaishuiCounty,BaishuiShaanxi,715600,China)

The artificial insemination for a bull is one of the most widely used reproductive technologies for animals,which contribute greatly to the genetic improvement for cattle.However,about 40% to 50% sperms lose motility during the freezing-thawing process,restricting the breeding performance of fine breed bulls.Based on analyzing the principle of sperm cryopreservation,the article elaborated sperm cryopreservation through permeable and impermeable cryoprotectant and low density lipoprotein,hoping to provide a reference for the research on developing new cryoprotectants so as to improve the quality of frozen semen.

bull;sperm cryoprotectant;cryopreservation principle

2013-12-2

西北农林科技大学基本科研业务费科技创新专项重点项目(QN2011061)

贾永宏(1966-)，男，陕西白水人，高级畜牧师，主要从事牛品种遗传改良和技术推广工作。E-mail:laojiatongzhi1988@163.com

*[通讯作者]胡建宏(1969-)，男，陕西白水人，博士，教授，主要从事家畜生殖生理调控方面的教学与科研工作。E-mail：hjh19732008@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)01-0005-04