人类单核苷酸多态性研究进展

苏 津 综述，包娜娜，李会来，陈占国 审校（河北省秦皇岛市抚宁县中医院 066300）

根据“人类基因组计划”，人类对自身基因组中的核苷酸序列进行了深入的了解与认识，这个计划的关键目标在于寻找功能基因，并且说明特定基因组区域里序列产生的差异［1］。单核苷酸多态性（SNP）在基因组中的序列差异最为普遍，在多个学科的领域中具有重要的意义，发挥着巨大的作用。SNP指在基因组水平中由单核的苷酸变异引发DNA的序列产生多态的变化，在人类遗传变异中最为常见，也是人类基因组计划后才进行研究的最新遗传标记。作者针对SNP的概念与特性，阐述其研究的价值与意义，并对研究方法进行综述，旨在探讨SNP在遗传学、生物医学以及人类进化史中发挥的作用。

1 SNP的概述

SNP作为基因组DNA中单碱基的序列差异，在人群中的分布率占1%以上，但是基因组里其他序列差异导致的变异不属于SNP范围，比如重复、缺失以及插入序列复制数目发生变化［2］。另外，SNP所引起的人类遗传基因多态性在遗传信息中的本质表现占90%以上。

从生物遗传的角度来说，SNP特点包括：（1）将两个随机染色体加以对比，每一千个碱基里面就会有一个SNP。（2）在基因内部中有部分SNP将对蛋白结构，或是表达水平造成直接影响，以利于充分了解疾病的遗传机制。（3）在进化史中，SNP仅发生过一次变异，因此其遗传特性更加稳定。（4）高通量SNP筛选随着SNP研究成本降低以及研究方法的发展，将对遗传学分析起到促进与推动的支持作用［3］。

2 SNP的研究价值

2.1 疾病病因在大多数人的概念中，每一种疾病均可发现遗传因素的影子［4］。SNP在基因组中的变异能够起到两个作用，一个是作为遗传学的一种分子标记物，另一个至关重要的作用就是能表达出基因和疾病之间的关系，对疾病中存在的有关基因进行搜索。对于部分单基因的遗传性疾病，采用家系研究方法对疾病的病因进行搜索的应用，在目前临床上已经取得了一定的成果。但是，在多基因疾病中，因为基因数目和影响疾病发生发展存在的差异，且环境因素也起到了重要作用，在病因学研究方面多基因疾病增加了很多的困难。SNP研究的重点为通过SNP图谱的构建，为寻求和疾病有关的基因，开展全基因方面的研究，在现阶段研究里面主要采取的研究方法就是直接法、间接法。直接法通过寻找cSNPs及基因编码，获取对疾病易感性产生影响的基因序列变异，并且根据对现在研究的分析，在人类基因序列编码区域中cSNPs的数量只有2、3个变异，其频率在10%以上，而编码区域内并不包括全部的功能性变异，因此不能被广泛应用。间接法所寻找的目标就是和致病性相关的中性多态位点，而且对于氨基酸编码和蛋白的结构不会被改变，且不会使表现型改变。但是，在染色体方面有些疾病有关的基因突变位点将可能发生连锁效应，甚至还会遗传至后代［5］。

2.2 药物基因组学人类基因组框架序列于2001年建立完成，与此同时，诞生了以个体遗传学为主，运用医源性药物原理，对患者临床的药效和不良反应加以评估的一门药物基因组学［6］。此学科利用基因组学的研究技术，比如生物学信息、化学信息、基因图谱、高通量DNA的检测序列，使得研究人员可以针对个体和群体间产生的药效差异予以准确遗传学基础的定性，主要在于对特定患者进行诊疗，防止药物造成不良反应及对药物靶点加以设计。通过个体化医疗手段对患者用药起到正面作用，并按照个体基因型的特异性对患者进行药物的优化配置，使得药物的临床疗效更为显著，不良反应更小。在药物基因组研究中，由于SNP位点的差异，将会对基因的表达、蛋白质结构、氨基酸的剪切以及编码产生巨大的影响，进而改变药物与受体以及转运体之间的相互作用，影响药物代谢［7］。在不断构建高密度SNP及相关药物代谢的SNP图谱的情况下，医生了解患者基因型后，认真对患者遗传档案加以分析，并对患者进行适宜药物的应用，以此避免药物产生不良反应。目前，临床所采用的药物应用条件需要根据患者的体质量、年龄等资料加以确定，而在未来发展过程中，此方法会逐渐由个体遗传信息取代。

2.3 人类进化史由于SNP对进化水平的变异有所体现，因此也可以对种群间的DNA序列变异进行研究。大多数SNP在基因组在蛋白质编码区域之外，如分布方面是不会受到选择的干扰，而且会长期保留下来。一些对蛋白编码区域内的表现型SNP产生影响，虽然会受到自然选择施加的压力，但若是可以长时间被保留下来，就能够对个体成功繁衍后代发挥促进作用，充分说明这些变异会受到选择的干扰，而且还会作为代表成为进化史中的部分关键事件［9］。所以，根据对不同物种相互之间的蛋白编码及非编码区和变异数目得出的比值予以计算，能够对进化树当中的分支点加以追溯，还能促进进化，并产生积极影响的变异，这样才可以在基因池中被固定保留。

3 研究方法与技术手段

在目前的SNP研究期间，很多技术会随生物学实验技术的进步发展而加以应用，具体表现为下面几方面。

3.1 微阵列杂交实验在SNP研究中可以将杂交实验方法作为研究的基础理论［10］。将SNP位点作为中心，再向两侧延伸10～20个碱基作为位点特异性探针，然后杂交包括该位点不同个体产生聚合酶链反应（PCR）的物质。该特异性探针具有较小的长度，所以可以对含有SNP位点碱基和靶DNA相匹配，从而对形成探针，也就是靶DNA复合物的稳定性产生关键作用，同时据此对不同个体位于此位点时表现的不同基因型加以辨别和对比。这种实验方法具体有两种模式，第一种适用于在规模较大的人群当中对少量SNP位点进行筛选，方法为将待测的DNA样品进行固定；第二种可于同一时间对大批量SNP位点进行统一分析，方法为采用微阵列将高密度探针在基片上进行固定，并且要制备数万个和ASO杂交以后PCR产物。如果可以实现这样的操作，应该将每个SNP位点之间所产生的PCR尽可能缩短，保证能够实现多重PCR。而且在PCR引物中应该存在通用尾巴，以利于二次扩增时，增加引物的使用效率，提高不同产物PCR的相似率［11］。当扩增完成以后，将点有ASO的基因芯片与包含多个SNP位点或是多重混合物的不同样品实验杂交，同时利用共聚焦显微镜技术检测荧光信号并记录，根据样本间的对比及对照成像对杂交结果详尽分析。此方法的问题主要是多重PCR具有一定程度的局限性，还有就是很多DNA样本和ASO探针相杂交时存在的复杂性及设备与设计高密度芯片的问题。

3.2 分子灯塔这项技术基于PCR反应对SNP位点进行区分，并需要由3个部分组成的杂交探针，两端为由荧光染料进行标记并可以参照SNP位点碱基的变化进行相应标记的DNA序列，中间为SNP位点的特异性序列。如果探针没有和序列实施特异性杂交的情况下，探针两端序列可以互补，从而产生发卡结构，致使两侧荧光材料因为过度紧密而发生荧光淬灭的现象［12］。如果探针和序列在特异性杂交的情况下，两种染料各自分离，致使荧光强度变为杂交前的900倍以上。此种方法比较简单便捷，但是探针杂交的稳定性却不能满足实验的预期效果。

3.3 测序这种方法为国际上应用最为广泛的SNP研究方法，具有直接、准确对序列差异进行反映、检测成本逐渐降低等优势。常用的手段就是PCR扩增产物的测序和随机性测序。

3.3.1 PCR扩增产物测序 该种手段经常被应用于验证及发现SNP中，利用PCR把可能调控区域和编码区域里面的序列表现于不同个体中加以扩增以后，再对扩增后的产物予以序列或是测序分析。这种方法仅对已知序列组区域内的SNP开展研究，成本比较昂贵且操作复杂，也不适合对SNP进行大规模的筛选。

3.3.2 随机测序 这种策略在目前的研究中流行两种方法，基因组比与不完全鸟枪法。前者采取的方法为对全基因组进行随机测序，并将其与人类基因组序列进行对比，将新发现的SNP在全基因组的序列图谱中进行定位。缺点在于，在发现SNP的结果仅为2条染色体序列之间的比较，易导致数据分析时随机误差的产生和引入测序错误的出现，致使其产生假阳性的结果。不完全鸟枪法关键是把不同个体内的DNA样品加以等量混合以后再构建基因文库［13］。随机性把全基因组核苷酸序列打断为基础，获取全基因组内的微量片段，然后对其采取随机测序，以至于其可以成倍的覆盖，从而在不同颜色体间相互重叠的区域对序列差异加以验证和发现，以利于搜索一些人群中的SNP。通常情况下，若是想把基因组内的部分区域取得比较大的覆盖度，这就需要进行大量的测序反应达到目的，但是因为随机测序方法内SNP选自不同个体构建的群体样品，加强了结果的可信度。

4 人类单核苷酸多态性的研究现状

根据现阶段国际标准，SNP的试验研究可以分为3个阶段，分别是发现、验证及筛选。而现在研究的重点倾向于第一个阶段，而这一阶段只能够获得与SNP有关的少量信息，例如多态位点在基因当中、染色体当中的定位，以及碱基的变异等。对于这个阶段得到的SNP，还要在小规模人群中进行验证，根据SNP的分布频率对常见或稀有的类型进行判断，以此来避免数据、实验处理等方面产生假阳性的结果［14］。下一步实验研究将选择更广阔的人群对SNP进行扫描，进一步确定不同人群中SNP的分布情况，同时寻找更低频率的SNP。对于不同人群之间的关系以及迁移情况，SNP的分布频率尤其是稀有SNP能够起到重要的提示作用。按照进化的观点可以总结出一个结论，常见SNP表明了变异相当久远，在人群中长久的保存下来，而且以固定的频率存在着；稀有的SNP表明，人群会在近期内出现变化。

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