一例人感染羊接触传染性脓疱皮炎的确诊

姚 俊，朱刚毅，陶正泽，刘保有，杨 聪，胡 骑，高 林，姚忠会，李华春

（1.云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，昆明 650224；2.云南省玉溪市江川县动物疫病预防控制中心，江川 652600；3.云南省玉溪市江川县雄关乡农业综合服务中心，江川 652600；4.文山州农业学校，文山 663000）

·简报·

一例人感染羊接触传染性脓疱皮炎的确诊

姚 俊1，朱刚毅2，陶正泽2，刘保有2，杨 聪3，胡 骑1，高 林1，姚忠会4，李华春1

（1.云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，昆明 650224；2.云南省玉溪市江川县动物疫病预防控制中心，江川 652600；3.云南省玉溪市江川县雄关乡农业综合服务中心，江川 652600；4.文山州农业学校，文山 663000）

2013年6月6日，云南省江川县动物疫病预防与控制中心的一名兽医在保定可疑羊接触传染性脓疱皮炎发病羊时不慎被羊咬伤手指，10 d后在伤口愈合处形成丘疹，随后发展为水疱，最后形成结痂。随着痂皮的逐渐脱落，直至丘疹出现后1个多月感染病灶才完全愈合。经过对发病羊口唇痂垢及人手指丘疹、水疱液样品进行PCR、Real-time PCR及序列比对分析，2份样品均扩增出1225 bp的预期大小片段，Real-time PCR也扩增出标准S形曲线和Rn指数增长峰，2份病料测定出的序列（1133 bp）完全一致，与NCBI GenBank中的羊口疮病毒参考毒株NC-005336.1（1133/1133）对应序列的相似性达到100%，与AY386264.1（1115/1133）、AY386263.1（1114/1133）、HM133903.1（1113/1133）、KF837136.1（1110/1133）及普洱毒株PUER/YN/CHIA/2011（1113/1133）对应序列相似性达到98%，与DQ184476.1（1104/1133）对应序列相似性达到97%，与NCBI GenBank中同为副痘病毒属成员的伪牛痘参考毒株GQ329669.1（1052/1140）、GQ329670.1（1051/1140）对应序列的相似性达到92%，与牛丘疹性口炎病毒参考毒株AY386265.1（905/1130）的对应序列的相似性仅达到80%。由此，确诊此次病例为人感染羊传染性脓疱病毒。

羊接触传染性脓疱皮炎；传染性脓疱病毒；感染

羊接触传染性脓疱皮炎（contagious ecthyma）也称羊口疮，是由羊接触传染性脓疱皮炎病毒（Orf virus，ORFV）感染引起绵羊、山羊的一种接触传染性、嗜上皮性传染病，病原是痘病毒科（Poxviridae）、副痘病毒属（Parapoxvirus）成员，同属成员还有伪牛痘病毒、牛丘疹性口炎病毒、新西兰红鹿副痘病毒、骆驼接触传染性臁疮病毒及海豹病毒[1]。羊接触传染性脓疱皮炎临床特征是在口唇、眼、乳房、鼻孔周围的皮肤上出现丘疹和水疱，并迅速变为脓疱，最后形成痂皮或疣状病变桑椹状痂垢[1]。人接触病羊时，常发生感染，病变多发生于手、腕或脸。先是丘疹，随后变为水疱和脓疱，周围皮肤红肿，局部疼痛，淋巴结肿大，最后结痂自愈。此病可以通过伤口感染饲养人员，表现为手背、指间和前臂部疱疹和破溃例。2005年8月福建省永安市有8名羊场养殖工人因感染羊传染性脓疱病毒而发病[2]。虽然羊接触传染性脓疱皮炎在我国被划分为三类动物疫病，但其流行地域广，严重影响羊的生产性能，若有肺脏继发感染存在时常可导致死亡，加之羊接触传染性脓疱皮炎病毒可感染人，对公共卫生安全和广大养羊户、兽医工作人员的身体健康造成严重威胁[3]，是一种危害较为严重的人畜共患传染病[4]。羊接触传染性脓疱皮炎最早于1920年发现于欧洲，现已遍布全世界[1,5]。中国新疆维吾尔自治区、甘肃省、青海省、内蒙古自治区、山西省、上海市、北京市、江苏省、福建省、贵州省、云南省、广西壮族自治区及东北地区均有报道[3,6-12]。2010年底至2011年初云南省普洱市放牧山羊暴发羊接触传染性脓疱皮炎[13]。2011年12月保山市放牧山羊也出现羊接触传染性脓疱皮炎的发生与流行[14]。

2013年6月初云南省玉溪市江川县雄关镇一养殖户养殖的黑山羊发生了以口唇形成桑椹状痂垢为特征的传染病，见图1。2013年6月6日江川县动物疾病预防与控制中心接到疫情报告后，立即派工作人员到现场调查、采样。其中一名工作人员采样和拍照时不慎被羊咬伤右手中指背侧，7 d后伤口基本愈合，10 d后伤口愈合处逐渐形成丘疹，随后发展为水疱，挤破后流出少许淡黄色液体，最后形成结痂，随着痂皮的逐渐脱落，直至伤口感染后1个多月才完全愈合，见图2。

图1 羊接触传染性脓疱皮炎发病羊口唇、鼻部出现的特征性病变——桑椹状痂垢Fig.1 The mulberry shape scab scales-the characteristic lesions of Orf virus infection appeared around lips and nostrils of the infected goats

图2 羊接触传染性脓疱皮炎患者伤口附近出现的丘疹、水疱Fig.2 The papules and blisters near the wound in the middle fi nger of the patient

经过对发病山羊口唇部桑椹状痂垢，以及感染人右手中指背侧病灶的痂皮及水疱液进行Real-time PCR检测及ORFVgORF010基因部分序列测定、分析，确诊此次病例为人感染羊接触传染性脓疱病毒。

1 材料与方法

1.1 样品可疑羊接触传染性脓疱皮炎口唇组织病料采集自云南省玉溪市江川县雄关镇；可疑羊接触传染性脓疱皮炎病羊咬伤后感染形成的丘疹及水疱液，来自云南省玉溪市江川县动物疫病预防与控制中心被咬伤工作人员；羊接触传染性脓疱病毒PUER/YN/CHIA/2011毒株牛睾丸细胞培养物，由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室从云南省普洱市患羊接触传染性脓疱皮炎的羊口唇组织分离获得，作为阳性对照。

1.2 主要试剂及仪器Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANgel Midi Purification Kit）、2×Taq PCR Master Mix、2.5×RealMaster Mix、20×Probe Enhancer Solution、DNA Marker（DL2000）购自天根生化科技（北京）有限公司；GeneAmp PCR System 9700 PCR仪、7500 Fast Real-Time PCR System实时荧光定量PCR仪、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer测序仪均为美国ABI（Applied Biosystems Incorporation）公司产品。

1.3 引物、探针ORFV TaqMan实时荧光定量PCR引物、探针参照姚俊等[5]报道的方法，ORFVgORF121-122-F: 5'-TCTATCGTCGCTACA TAC-3'；ORFVgORF121-122-R: 5'-GCTTCT TATTTCACATTACAG-3'；ORF121-122-probe: FAM-5'-CTAAGACACTACTCGCCACGC-3'-BHQ1。

PCR引物参考NCBI GenBank中羊接触传染性脓疱病毒（Orf virus）基因组（登录号：NC_005336.1）ORFgORF010 基因（putative EEV maturation protein）DNA序列设计并合成：ORFVgORF010-F: 5'-ACGCCAGTCGGAAG CAG-3'；ORFVgORF010-R: 5'-AGGGACGGG AAGACGATG-3'。扩增片断长度为1225 bp，最适退火温度为 60.8℃。

1.4 DNA抽提将病料与1×MEM按照1:5（W/V）的比例匀浆后3750×g离心5 min，取上清液按Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒说明书抽提病毒DNA。

1.5 ORFV ORFgORF010 基因PCR扩增运用上述针对ORFgORF010 基因设计的PCR上下游引物，对山羊口唇痂垢及人右手中指背侧丘疹、水疱液抽提的DNA样品进行PCR扩增。PCR反应体系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上游引物ORFgORF010-F、下游引物ORFgORF010- R 各4 μL，模板8 μL，PCR级无离子水9 μL。反应条件：95℃预变性10 min，然后95℃ 1 min、60℃40 s、72℃ 2 min 进行45 个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并将目的条带切胶回收纯化后测序。

1.6 ORFV TaqMan实时荧光定量PCR检测运用上述针对ORFVgORF121-122基因设计的TaqMan实时荧光定量PCR引物、探针[5]，对山羊口唇痂垢及人右手中指背侧丘疹、水疱液抽提的DNA样品进行Real-time PCR扩增。方法如下，25 μL反应体系：2.5 ×RealMaster Mix 10 μL，20×Probe Enhancer Solution 1.25 μL，上游引物ORFVgORF121-122-F、下游引物ORFVgORF121-122-R及探针ORF121-122-probe各1 μL，灭菌ddH2O 7.75 μL，模板3 μL。反应条件：95℃预变性10 min，然后95℃ 3 s、60℃ 10 s、72℃ 30 s，反应 50个循环。

1.7 ORFV ORFgORF010 基因核苷酸序列测定及分析运用DNAStar 5.01软件包对测定出的序列进行拼接、校正后，导入NCBI BLAST进行同源序列比对分析。运用MEGA6.0软件包对获得的序列与NCBI GenBank中的羊接触传染性脓疱病毒参考毒株NC-005336.1、AY386264.1、AY386263.1、HM133903.1、KF837136.1、DQ184476.1及普洱毒株PUER/YN/CHIA/2011，以及与同为副痘病毒属成员的NCBI GenBank中的伪牛痘参考毒株GQ329669.1、GQ329670.1和牛丘疹性口炎病毒参考毒株AY386265.1的对应序列进行比对（ClustalW法），构建系统发生树（Minimum-Evolution Tree）。

2 结果与讨论

2.1 ORFV ORFgORF010 基因PCR扩增结果山羊口唇痂垢及人右手中指背侧丘疹、水疱液抽提DNA样品PCR，均扩增出预期大小的1225 bp DNA片段，结果见图3。

2.2 ORFV TaqMan实时荧光定量PCR检测结果阳性对照及山羊口唇痂垢及人右手中指背侧丘疹、水疱液抽提DNA样品Real-time PCR均扩增出标准S形曲线（Delta Rn vs Cycle）和荧光值指数增长峰（Rn vs Cycle），阴性对照未扩增出任何S形曲线（Delta Rn vs Cycle）和荧光值指数增长峰（Rn vs Cycle），结果见图4。

图3 ORFV ORFgORF010 基因PCR产物电泳图Fig.3 PCR product of ORFV ORFgORF010 gene

图4 ORFV Real-time PCR（Rn vs Cycle）扩增图Fig.4 The amplifi cation plot of Real-time PCR (Rn vs Cycle) of ORFV

2.3 ORFV ORFgORF010 基因测序及比对分析结果2份病料测定出的核苷酸序列（1133 bp）完全一致，与NCBI GenBank中的羊接触传染性脓疱病毒参考毒株NC-005336.1的对应序列的相似性达到100%；与AY386264.1（1115/1133）、AY386263.1（1114/1133）、HM133903.1（1113/1133）、KF837136.1（1110/1133）及普洱毒株PUER/YN/CHIA/2011（1113/1133）的对应序列的相似性达到98%；与DQ184476.1（1104/1133）的对应序列相似性达到97%；与NCBI GenBank中同为副痘病毒属成员的伪牛痘参考毒株GQ329669.1（1052/1140）、GQ329670.1（1051/1140）的对应序列的相似性达到92%；与牛丘疹性口炎病毒参考毒株AY386265.1（905/1130）的对应序列的相似性仅达到80%。根据上述序列比对结果可确诊此次为人感染羊接触传染性脓疱病毒病例。运用ClustalW法比对序列后构建Minimum-Evolution Tree，可见JC和PUERYN毒株与NCBI GenBank中的6株羊接触传染性脓疱病毒参考毒株同属于一个进化分支，其中JC株与NC-005336.1株处于一个小分支，PUER-YN与HM133903.1处于另一小分支，牛丘疹性口炎病毒参考毒株AY386265.1与伪牛痘参考毒株GQ329669.1、GQ329670.1各处于不同进化分支，进化树见图5。

图5 ORFV ORFgORF010 基因系统发生树Fig.5 Phylogeny tree based on ORFV ORFgORF010 gene

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A HUMAN CASE OF CONTAGIOUS ECTHYMA VIA CONTACT WITH A DISEASED GOAT

YAO Jun1, ZHU Gang-yi1, TAO Zheng-ze2, LIU Bao-you2, YANG Cong3, HU Qi1, GAO Lin1, YAO Zhong-hui4, LI Hua-chun1
(1.Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases Laboratory, Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224,China; 2. Jiangchuang Center for Prevention and Control of Animal Disease, Jiangchuan 652600, China; 3. Xiongguang Township Center for Comprehensive Agricultural Service, Jiangchuan 652600, China; 4. Wenshan Agricultural School,Wenshan 663000,China)

The present report described a human case of contagious ecthyma due to a bite by a diseased goat. On June 6th, 2013, the right middle fi nger of a veterinarian at Jiangchuan Center for Prevention and Control of Animal Disease, Yunnan Province was bitten by a goat suspicious of contagious ecthyma when he was examining the animal. Pimples formed near the wound spot 10 days later, following byblisters and scabs. As scabs fell off gradually, local lesions were healed. The case lasted for more than one month since pimples emerged. Pimple samples were collected from the goat and human and tested by PCR, Real-time PCR and sequence analysis. A 1225 bp DNA fragment was amplifi ed in PCR and S shaped curves and Rn exponential growth peaks were amplifi ed in Real-time PCR. The nucleotide sequences of PCR products of human and goat samples were identical and 1133 bp in length. Alignment of this nucleotide sequence with other available sequences demonstrated its identity at 100% with Orf virus reference strain NC-005336.1(1133/1133) in GenBank, 98% with orf strains AY386264.1 (1115/1133), AY386263.1 (1114/1133), HM133903.1 (1113/1133) , KF837136.1 (1110/1133) and Yunnan strain PUER/YN/CHIA/2011 (1113/1133), and 97% with DQ184476.1 (1104/1133). In addition, the identity to Parapoxvirus members pseudo-cowpox virus reference strain GQ329669.1 (1052/1140), GQ329670.1 (1051/1140) was 92% and to bovine popular stomatitis virus reference strain AY386265.1 (905/1130) was 80%. Therefore, this case of human infection was confi rmed via direct contact with diseased goat.

Contagious ecthyma; Orf virus; infection

S852.659.1

B

1674-6422（2014）03-0069-06

2013-11-07

云南省科技厅重大科技专项（2012ZA017）；云南省科技厅应用基础研究（2010ZC225）

姚俊，男，硕士，副研究员，主要从事动物病毒学研究

李华春，E-mail：li_huachun@hotmail.com