紫杉醇生物可降解支架对猪损伤后胆管α平滑肌动蛋白及转化生长因子β1表达的影响

杨瑾 蔡秀军

紫杉醇生物可降解支架对猪损伤后胆管α平滑肌动蛋白及转化生长因子β1表达的影响

杨瑾 蔡秀军

目的 观察紫杉醇涂层生物可降解支架对猪损伤后胆总管愈合过程中的α平滑肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。方法采用浸泡法制作紫杉醇涂层生物可降解胆道支架。构建猪肝外胆管损伤修复模型，将紫杉醇生物可降解支架及裸支架分别置入猪胆管中，每组15只（分别为实验组及对照组）。分别于术后1、3、6个月各处死5只并取材，观察吻合口愈合情况，行免疫组化测定吻合口α-SMA和TGF-β1的表达情况。结果自行研制造的全新紫杉醇生物完全可降解胆道支架获得成功。实验组术后1、3、6个月α-SMA及TGF-β1着色强度及面积评分较高的分布均较对照组低，其中术后3、6个月两组的差异有统计学意义（P＜0．05）。实验组术后6个月与术后1、3个月α-SMA着色强度及面积评分分布的差异均有统计学意义（P＜0．05），而对照组术后6个月仅与术后3个月的差异有统计学意义（P＜0．05）。实验组术后3、6个月与术后1个月TGF-β1着色强度及面积评分分布的差异均有统计学意义（均P＜0．05），而对照组术后6个月仅与术后1个月的差异有统计学意义（P＜0．05）。结论紫杉醇涂层生物可降解支架能降低猪损伤后胆管α-SMA、TGF-β1的表达，可在一定程度上抑制胆管狭窄趋势。

紫杉醇 药物洗脱支架 胆道 α平滑肌动蛋白 转化生长因子β1

目前，胆道狭窄的处理仍是胆道外科的一大难题，突出表现为术后胆道瘢痕性挛缩和管腔狭窄，其成因主要与胆管壁特殊的组织结构与生理特点有关。胆总管属于纤维弹性管道，愈合过程中由于受到胆汁、细菌感染等反复刺激导致巨噬细胞大量聚集，持续合成转化生长因子β1（TGF-β1）等生长因子而使黏膜下大量原有的纤维细胞转化为功能活跃的成纤维细胞，导致胶原过度合成，管腔瘢痕形成。成纤维细胞在TGF-β1持续刺激下还可转化为肌成纤维细胞（MF月）。从成纤维细胞到MF月需要有α平滑肌动蛋白（α-SMA）的表达，α-SMA的表达是MF月分化最显著的标记。而MF月的大量增生被认为是导致胆管瘢痕性挛缩的重要原因。紫杉醇是一种从红豆杉中分离得到的天然抗癌药物，可以抑制胆管上皮细胞与成纤维细胞的增生与迁移。本研究通过将紫杉醇涂层多聚乳酸生物可降解支架应用于猪胆管损伤模型，动态观察该支架对猪损伤后胆管的TGF-β1和α-SMA表达的影响，评估其对胆管损伤后瘢痕狭窄形成的防治作用，从而为临床防治胆道狭窄探索新途径。

1 材料和方法

1.1 紫杉醇涂层多聚乳酸生物可降解支架的制备 主体支架为聚左旋乳酸生物可降解支架，由浙江大学高分子材料系协助合成。涂层材料为共聚物P（LLA-co-CL），以单体L-丙交酯（L-LA）和ε-己内酯（ε-CL）为原料，开环聚合而成。紫杉醇涂层材料配方为100mg紫杉醇粉末+900mg P（LLA-co-CL）+40ml四氢呋喃（THF）。将P（LLA-co-CL）共聚物切割成细小颗粒状，按上述比例与紫杉醇粉末溶于两者的共同溶剂THF中。将已经灭菌处理的聚左旋乳酸胆道支架逐一浸泡于上述溶液中，顷刻拿出后经真空烘干箱于30℃、-0.1Mpa条件下烘干至衡重。对照组支架为无紫杉醇药物的涂层支架，涂层材料配方为900mg P（LLA-co-CL）+40mlTHF，制作方法同上。

1.2 实验动物及手术方式 健康巴马小型猪30只（上海妙迪生物科技有限公司提供），体重12～15kg。随机分为紫杉醇支架组（实验组）和裸支架组（对照组），每组15只。采用氯胺酮、速眠新Ⅱ联合麻醉。距十二指肠上缘2cm处游离出胆总管（上下游离范围不超过1cm），沿横向切开胆总管前壁制作胆管损伤模型，切开范围不超过胆总管两侧纵轴，约为其周径1/3～1/2。将已制备的紫杉醇可降解支架或裸支架置入胆总管内。以4-O Vicryl线作黏膜对黏膜外翻全程吻合，针距约0.5～0.6cm，边距0.3～0.4cm。

1.3 标本采集及指标检测 两组分别于术后1、3、6个月各取5只小猪，从原切口进腹。观察腹腔粘连情况及吻合口愈合情况。剪开吻合口观察大体标本后，取吻合口及上下0.5cm左右胆管组织浸泡于10%甲醛溶液中固定，行SMA、TGF-β1免疫组化染色。兔抗猪α-SMA多克隆抗体购自Abcam，免疫组化染色试剂盒购自中杉金桥生物技术有限公司，严格按照试剂盒说明操作。兔抗猪TGF-β1多克隆抗体购自月iovision公司，二步法抗兔通用型免疫组化检测试剂盒购自基因科技有限公司，严格按照试剂盒说明操作。

1.4 结果判定 正常胆管α-SMA阳性仅表达于胆管、血管壁的少量平滑肌。以细胞质和/或细胞膜染成棕黄色为阳性，α-SMA阳性表达于MF月胞质、血管、胆管平滑肌、中性粒细胞和淋巴细胞等炎性细胞。正常胆管TGF-β1表达阴性。以细胞质和/或细胞膜染成棕黄色为阳性。TGF-β1阳性细胞表达于肉芽组织、F月、巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等炎细胞及血管内皮细胞、平滑肌细胞胞质和细胞膜。根据阳性细胞的着色强度评分：“-”为阴性细胞，评为0分；“+”为细胞膜和/或细胞质染成淡棕黄色，评为1分；“+++”为深棕色评为3分；“++”则介于“+”与“+++”之间，评为2分。阳性细胞面积评分：阳性细胞所占面积＜总细胞数的25%评为1分；25%～50%评为2分；＞50%评为3分。两项分数相加，即为最终得分。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，组间比较采用非参数检验，独立样本采用Mann-Whitney U检验，配对样本采用Wilcoxon符号秩和检验。

2 结果

本实验成功制备紫杉醇生物完全可降解胆道支架，测得支架紫杉醇载荷量为（923±7.40）μg。

2.1 大体形态学观察 所有手术均顺利完成，麻醉满意，无术中死亡发生。两组动物术后均恢复顺利，无死亡及明显胆瘘、胆道梗阻发生。术后1个月两组胆管略有水肿，吻合口支架均在位，吻合口愈合良好；术后3个月支架均完全降解，实验组吻合口无明显狭窄现象，对照组可见胆管壁增厚，吻合口狭窄，远端胆管扩张；术后6个月实验组胆管无明显扩张狭窄现象，对照组胆管壁增厚，吻合口狭窄、远端胆管扩张较为明显。

2.2 两组免疫组化染色情况 见图1。

2.3 两组α-SMA不同阳性程度分布的比较 见表1。

表1 两组α-SMA不同阳性程度分布的比较（例）

由表1可见，实验组术后1、3、6个月α-SMA着色强度及面积评分较高的分布均较对照组低，其中术后3、6个月两组的差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组术后6个月与术后1、3个月α-SMA着色强度及面积评分分布的差异均有统计学意义（均P＜0.05），而对照组术后6个月仅与术后3个月的差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 两组TGF-β1不同阳性程度分布的比较 见表2。

图1 免疫组化染色（A：α-SMA阳性表达；B：血管平滑肌α-SMA自身阳性内对照表达；C：TGF-β1阳性表达；D：血管平滑肌TGF-β1自身阳性内对照表达；×400）

表2 两组TGF-β1不同阳性程度分布的比较（例）

由表2可见，实验组术后1、3、6个月TGF-β1着色强度及面积评分较高的分布均较对照组低，其中术后3、6个月两组的差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组术后3、6个月与术后1个月TGF-β1着色强度及面积评分分布的差异均有统计学意义（P＜0.05），而对照组术后6个月仅与术后1个月的差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

目前，损伤后胆管纤维化狭窄的处理仍是临床胆道外科的一大难题[1]。随着胆道外科工作的不断普及和腹腔镜手术的逐步推广，损伤后胆管狭窄的问题，变得更加突出。据统计，胆道术后继发胆管狭窄的发生率高达70%～80%，更有甚者由此引发阻塞性黄疸、多脏器功能损害甚至死亡等严重并发症。当前临床上尚缺乏理想的干预手段来有效的防治术后胆道瘢痕狭窄，如何预防及治疗胆管狭窄已成为当今外科界所面临的棘手问题。

紫杉醇是从红豆杉中分离得到的一种天然抗癌药物，可以牢固结合于微管β亚单位并可抑制微管动力，激活或调节多种与凋亡相关的基因或蛋白，抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。现作为一线药物广泛应用于多种肿瘤的临床治疗[2-3]。目前的研究表明，紫杉醇不仅能作用于多种肿瘤细胞，还能抑制血管平滑肌细胞，胆管上皮细胞与成纤维细胞的增生与迁移。这为其应用于肿瘤以外领域奠定了扎实的理论基础。

近年来，关于紫杉醇防治血管狭窄及组织纤维化方面的研究与报道渐增。国内外多项研究报道了紫杉醇在治疗冠状动脉狭窄、硬皮病及预防青光眼术后瘢痕形成等方面的确切疗效[4-6]。紫杉醇在抗胆管纤维化狭窄方面的研究尚属起步阶段。Park等[7]利用尼龙线留存鼠胆总管制成增殖性胆管炎模型，成功验证了局部一次性给予紫杉醇药物能在短期内有效防止鼠胆管狭窄形成的结论，但具体机制不明。Choi等[8]通过体外培养细胞实验证实，紫杉醇能抑制由大肠杆菌脂多糖引起的肌成纤维细胞的过度增生及Ⅰ型胶原蛋白的合成，并认为与其特异性地阻断TGF-β1信号通路有关。Liu等[9]的研究也证实，低剂量紫杉醇能够显著抑制TGF-β1/Smad活性从而有效缓解硬皮病小鼠的纤维化程度。

TGF-β1是目前已知的与瘢痕形成最为密切、最具代表性的细胞因子，在损伤、炎症及纤维化之间起着一个连接的作用[10]。它能影响愈合过程的所有阶段，提供正常愈合所必需的信号物质，当这些信号受抑制、阻断或过度表达时则可引起愈合不良或形成瘢痕。动物实验证实，在胆管术后3～6个月伤口愈合晚期，TGF-β1在术后狭窄胆道组织中为高表达。由此可见，设法减少胆汁刺激引起炎症反应的量和程度，抑制TGF-β1过度表达及其活性，理论上将有助于预防和减轻术后胆道瘢痕增生和管腔狭窄。为此，笔者设计研发了紫杉醇涂层多聚乳酸支架，它是一种完全可降解支架，在体内可以彻底降解为水和二氧化碳，不会引起炎症反应和生物毒性。支架在位时可支撑吻合口、对抗胆管瘢痕收缩应力，有利于吻合口成形，并在一定程度上起到隔绝胆汁的作用；同时，其作为药物载体，在达到药物缓释效果后可完全降解，免除了拔管及相应并发症的发生，也摆脱了以往金属支架永久存留的不良反应。本文结果显示，实验组各时间点TGF-β1的表达均低于对照组，其中术后3、6个月两组间的差异有统计学意义，证实支架持续释放的紫杉醇药物可抑制TGF-β1过度表达及其活性，从而达到减缓胆管纤维化狭窄的作用。

MF月在增生性瘢痕和纤维化疾病中持续存在被认为是导致胆管瘢痕性挛缩的主要原因。从成纤维细胞到MF月需要有α-SMA的表达，α-SMA的表达是MF月分化最显著的标记，实际上也就成为MF月的重要标志[11]。研究α-SMA在伤口愈合过程中的表达，可以更精确地了解MF月的生活周期和作用。本文结果显示，对照组α-SMA各期表达均强于实验组，其中术后3、6个月两组间的差异有统计学意义，提示紫杉醇可以抑制成纤维细胞向MF月。目前，紫杉醇调控α-SMA表达的机制仍不明确，可能与TGF-β1有关。α-SMA在TGF-β1作用下促进肌成纤维细胞的增殖[12]，紫杉醇通过阻断TGF-β1信号系统引起相应的α-SMA的减少，从而进一步抑制MF月的数量与功能。同时，TGF-β1还可通过自分泌方式正反馈调节TGF-β1mRNA及蛋白的表达与分泌。上皮下的TGF-β1可刺激成纤维细胞转化为MF月，从而促进其产生更多的TGF-β1与Ⅰ型胶原蛋白，正反馈机制可逐步放大TGF-β1的增殖效应，最终导致胆管壁纤维化增厚。因此，早期抑制TGF-β1的活性与数量，阻断其正反馈回路，理论上可影响之后的纤维化进程。

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Effect of paclitaxel-eluting biodegradable stent on expression of α-SMA and TGF-β1 in swine bile duct after injury

Objective To investigate the effect of a biodegradable paclitaxel-eluting biliary polylactide stent on the expression of α-smooth muscle actin(α-SMA)and transforming growth factor-beta1(TGF-β1)in swine bile duct after injury．MethodsThe paclitaxel-eluting biodegradable biliary polylactide stents were prepared by immersion method．A porcine bile duct injury model was established．Paclitaxel-eluting biodegradable stent were surgically inserted in the bile duct of 15 swines in experimental group,while biodegradable stent without paclitaxel were placed in rest 15 swines of control group．Animals were sacrificed 1,3 or 6 months after operation．The wound healing of the common bile duct was observed．The expression of α-SMA and TGF-β1 was also detected with immunohistochemical method．ResultsThe scores of staining intensity and the proportion of positively stained cells of α-SMA and TGF-β1 in paclitaxel group 3 and 6 months after the operation were lower than those in control group(P＜0．05)．In paclitaxel group,the difference of the score of staining intensity and the proportion of positively stained cells of α-SMA and TGF-β1 between 6 months after operation and 1 or 3 months after operation was significant(P＜0．05), whereas in control group,the difference was significant only between 6 months and 3 months(P＜0．05)．ConclusionLocal delivery of paclitaxel via a biodegradable stent can decrease the expression of α-SMA and TGF-β1 in the healing process of injured swine bile duct,which may be potentially used to relieve the billiary stricture．

Paclitaxel Drug-eluting stents Billiary tractα-SMA TGF-β1

2013-05-31）

（本文编辑：欧阳卿）

310014 杭州，浙江省人民医院胃肠外科（杨瑾）；浙江大学医学院附属邵逸夫医院普外科（蔡秀军）