米曲霉种曲制备工艺优化研究

赵中开，林 艳，杨建刚*，马莹莹，林 秋，吴赫川

（四川理工学院 生工学院，四川 自贡 643000）

米曲霉（Aspergillus oryzae）是美国食品药品监督管理局公布的40多种安全微生物菌种之一[1]，是食品酿造中的常用菌株，它不仅产酶种类多[2-3]，而且酶活力高，广泛分布于各种酒曲中，是酿酒工业中的重要微生物。毛青钟等[4]利用米曲霉制黄酒麦曲，所得曲的糖化力、液化力都得到很大的提高，此外，清酒曲是以大米为原料，以米曲霉为菌种，采用纯种培养的方法制成的酒曲。种曲即为酒曲制作时的种子[5]，是高度富含制曲微生物孢子的生物制品，其在纯种制曲领域占据着至关重要的地位[6-7]。目前，国外的种曲研究比较深入，生产应用也比较普及，而我国这方面的研究与生产相对落后，有待进一步加强[8]。

目前，我国已有关于米曲霉种曲的论文报道[9-10]，但是有关酿酒用米曲霉种曲的研究所见不多。该试验在前人所做研究的基础上，以籼米为制曲原料，以种曲孢子数为优化指标[11]，采用均匀试验设计方法进行试验方案设计[12]，对米曲霉种曲的制备工艺进行优化，以期为制备优良的米曲霉酒曲提供保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米曲霉（Aspergillus oryzae）A52820121203：酿造酒实验室保藏。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，水1 000 mL，pH自然。

籼米：市售；酿造水，符合GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》。

葡萄糖（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；乙醇体积分数95%：成都市新都区木兰镇工业开发区；木灰：市售；无菌水：酿酒实验室制备。

1.2 仪器与设备

LHP-250恒温培养箱：常州普天仪器制造有限公司；BH200生物显微镜：宁波舜字仪器有限公司；SYQ-DSX-280B高温蒸汽灭菌锅：申安医疗器诫厂；6102电子天平：杭州友恒称重有限公司；BCD-256L电冰箱：青岛乐家电器有限公司；WJ-JZX无菌接种箱：济南杰康济南净化设备厂；血球计数板：玉环县求精医用仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 种曲制作工艺流程

1.3.2 工艺操作说明

洗米：除去附在碎米表面的杂质，如糠、尘土及夹杂物等。

浸米：由于籼米的吸水性较差，故需浸泡较长时间，在20 ℃的条件下，需浸泡12 h以上。当米粒从外观上看透明感消失，变成纯白色，用手碾米粒能将米粒碾碎时，即可将籼米捞出，沥水0.5 h后，分装蒸米。

蒸米：用高压蒸汽灭菌锅蒸米，条件为110 ℃、45 min。使蒸出的籼米熟而不烂，内无白心生米。

接种：以无菌操作的方式按照相应的接种量接入米曲霉孢子粉。

添加木灰：以无菌操作的方式按照相应的木灰添加量加入木灰，拌匀。木灰是米曲霉种曲制备过程中非常关键的一种添加物，其主要作用体现在两个方面，一是为米曲霉的生长提供必要的矿物质元素，促进米曲霉产生孢子；二是使培养基更加的松散，为培养基内部通气和散热创造条件。

扣瓶：米曲霉是一种好氧性微生物[13]，其菌丝在生长时会相互缠绕，造成米粒结块，导致曲料内部缺氧，因此应及时扣瓶，将结块的米粒打散。本试验的扣瓶频率为每12 h一次。

种曲培养：接种后第1天为米曲霉孢子的萌发阶段，温度为31 ℃，从第2天起根据不同试验要求设定培养温度（14～46 ℃）。根据不同试验设定培养时间为1～10 d，培养结束时一般肉眼可观察到大量绿色米曲霉分生孢子的生成。

1.3.3 孢子数测定

样品稀释：精确称取种曲1.00 g，倒入盛有玻璃珠的250 mL锥形瓶内，加体积分数95%酒精5 mL，加无菌水20 mL，加稀硫酸10 mL，充分振摇，使分生孢子分散，然后用多层纱布过滤、冲洗，使滤渣不含孢子，稀释至500 mL。

制片：用胶头滴管取稀释液l滴，滴于血球计数板的计算格上，然后将盖玻片轻轻由一边向另一边压下，使盖片与计数板完全密合，计数区内无气泡，用滤纸吸干多余的溢出孢子液，静置数分钟，待孢子沉降。

观察计数：采用血球计数板计数，用低倍镜头或高倍镜头观察。孢子常位于大格的双线上，应全部取二边计数，舍弃另二边，以免重复计数。本试验采用的是25×16型的计数板，需要数左上、左下、右上、右下和中间共计5个大格的孢子数，每个样品重复观察两次，其平均值即为该样品种曲的孢子数，孢子数计算公式如下。

式中：N表示80个小格内的孢子总数，个；n表示稀释倍数。

1.3.4 单因素试验

接种量对种曲孢子数的影响：在250 mL三角瓶中分别装入30 g已浸泡并沥干水的大米，经高压灭菌锅灭菌后，分别按接种量0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%接入米曲霉孢子粉，再分别添加1%的木灰，拌匀后31 ℃培养1 d，30 ℃培养4 d，前两天每隔12 h扣瓶一次，培养结束后计种曲孢子数。

木灰添加量对种曲孢子数的影响：在250 mL三角瓶中分别装入30 g已浸泡并沥干水的大米，经高压灭菌锅灭菌后，分别按上述所确定的最佳接种量接入米曲霉孢子粉，再分别添加0、1%、2%、3%、4%的木灰，拌匀后按上述条件培养，培养结束后计种曲孢子数。

温度对种曲孢子数的影响：在250 mL三角瓶中分别装入30 g已浸泡并沥干水的大米，经高压灭菌锅灭菌后，分别按上述所确定的最佳接种量接入米曲霉孢子粉，最佳的木灰添加量加入木灰，拌匀后31 ℃培养1 d，而后分别在14 ℃、22 ℃、30 ℃、38 ℃、46 ℃培养4 d，前两天每隔12 h扣瓶一次，培养结束后计种曲孢子数。

时间对种曲孢子数的影响：在250 mL三角瓶中分别装入30 g已浸泡并沥干水的大米，经高压灭菌锅灭菌后，分别按上述所确定的最佳接种量接入米曲霉孢子粉，以最佳的木灰添加量加入木灰，拌匀后31 ℃培养1 d，而后分别在上述所确定的最佳温度下培养，包括种子萌发培养时间（1 d）分别培养3 d、5 d、7 d、9 d、11 d，前两天每隔12 h扣瓶一次，培养结束后计种曲孢子数。

1.3.5 均匀试验设计方案

在单因素试验的基础上，以接种量、木灰添加量、培养时间和温度为优化种曲孢子数的4个因素，确定各因素与水平，具体的因素水平见表1。

其中，对温度取4个水平，其余3个因素均取6个水平，具体的因素水平见表1。

表1 孢子数优化均匀试验因素水平Table1 Factors and levels of the uniform experiment for spore number optimization

2 结果与分析

2.1 单因素试验优化米曲霉培养条件

2.1.1 接种量对种曲孢子数的影响

不同接种量下培养结束后种曲孢子数结果见图1。由图1可知，接种量小时，接入的生物量不足，培养基的营养过剩，种曲的孢子数也少，随着接种量增加种曲孢子数量也在增多，当接种量增加至0.10%时，种曲孢子数最多，故选择接种量为0.10%。

图1 接种量对种曲孢子数的影响Fig.1 Effect of inoculum on spore number of seed koji

2.1.2 木灰添加量对种曲孢子数的影响

图2 木灰添加量对种曲孢子数的影响Fig.2 Effect of wood ash addition on spore number of seed koji

不同木灰添加量下培养结束后种曲中孢子数测定结果见图2。木灰的添加量过多过少都会影响种曲孢子的数量，一定量的木灰不仅可以为米曲霉的生长提供必要的矿物质元素，促进米曲霉产生孢子，还可以使培养基更加松散，为培养基内部通气和散热创造条件，由图2可以看出，种曲孢子数随木灰添加量先增加后减少，当木灰添加量为1%时，种曲孢子数最多，故选择木灰添加量为1%。

2.1.3 温度对种曲孢子数的影响

不同培养温度下培养结束后种曲中孢子数测定结果见图3。由图3可知，微生物的活动受温度影响极其明显，微生物的生长均有其特定的最佳温度范围，温度过低过高都影响其体内的生理生化反应，如酶活性，从而影响其生长代谢。米曲霉的最适生长温度30～35 ℃，＜25 ℃生长缓慢，＞40 ℃生长困难。培养温度过低或过高，均无法产孢子，在培养温度30 ℃时种曲孢子数最多，故选择培养温度为30 ℃。

图3 培养温度对种曲孢子数的影响Fig.3 Effect of culture temperature on spore number of seed koji

2.1.4 培养时间对种曲孢子数的影响

图4 培养时间对种曲孢子数的影响Fig.4 Effect of culture time on spore number of seed koji

不同培养时间下培养结束后种曲中孢子数测定结果见图4。由图4可知，培养时间过短，菌丝处于营养生长阶段，产孢子不足，随着培养时间的增加，米曲霉生长进入繁殖阶段，大量分生孢子形成，种曲孢子数增多，在第7天达到最高值，而后随时间延长，易产生大量的休眠孢子，也有一部分孢子二次萌发，种曲孢子数趋于稳定。故选择培养时间为7 d。

2.2 均匀试验优化米曲霉种曲培养条件

由于本试验中包含3个6水平因素和1个4水平因素，故需采用混合水平均匀设计表来安排试验。根据本试验的实际情况，尽量减少试验误差，选用均匀试验表U12（12×62×4）来安排试验。由于该表的第1列有12个水平，所以还需采用拟水平法将该列相邻的2个水平合并为因素水平表中的1个水平，试验方案详见表2，模型回归统计与方差分析见表3～表5。

由表2可以看出，各因素的相关组合下米曲霉种曲的产孢子数的变化。当培养时间为8 d，接种量为0.10%，木灰添加量为1.8%，培养温度30 ℃时，种曲产孢子数最多，为5.9×108个/g。

应用SPSS软件中的线性回归分析程序对试验数据进行处理[14-15]，得到统计结果见表3～表5。

表2 均匀试验设计方案及结果Table 2 Designation and results of uniform experiment

表3 模型回归统计Table 3 Model regression statistics

表4 回归方程的方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

表5 回归系数方差分析Table 5 Variance analysis of regression coefficient

由表3可知，该模型的R2=0.952，说明该回归方程拟合较好。由表4可知，P=0.001（＜0.05），说明回归方程模型是极显著的。由表5可知，回归方程Y=7.996-0.482X2-0.083X12-0.004X42+0.509X1X3-0.048X3X4，根据R2=0.952和表4中方差分析可以判断回归方程非常显著（P＜0.01）；再根据t检验结果，所有的偏回归系数也都显著（P＜0.05）。所以，建立的回归方程有意义。

由表5可知，各因素对种曲孢子数影响的主次顺序为：X1X3＞X12＞X3X4＞X2＞X42。

利用Excel的规划求解功能对回归方程进行求解，得到的极值点为：X1=6.43，X2=0.1，X3=2.1，X4=25，按实际操作即培养时间6.4 d，接种量0.1%，木灰添加量2.1%，培养温度25 ℃。将此最佳培养条件代入回归方程，得到最佳培养条件下的预期孢子数为6.37×108个/g。在最佳条件下对预测值进行验证，最后得到的孢子数真实值为6.33×108个/g，与预测值接近。

3 结论

试验以籼米为原料，应用均匀试验设计方法对米曲霉种曲的制备工艺进行了研究。经均匀试验优化后，确定按实际操作的最佳培养条件为：培养时间6.4 d，接种量0.1%，木灰添加量2.1%，培养温度25 ℃。在此条件下制备的种曲的孢子数为6.33×108个/g，与预测值很接近，说明回归模型较为可靠。通过本试验种曲制备的优化，在酿造生产中可直接减少种曲用量，有利于经济效益的提高。

[1]张横成.生料发酵法酿造液体醋工艺应用实验报告[J].中国酿造，1989，8（5）：40-43.

[2]梁姚顺.酱油菌种米曲霉的研究及条件优化[D].广州：华南理工大学硕士论文，2006.

[3]鲁梅芳，綦 伟，曹小红，等.米曲霉A100-8 种曲的培养工艺的研究[J].中国酿造，2009，28（5）：20-25.

[4]赵中开，龙 可，马莹莹，等.米曲霉菌在酿酒工业中的研究进展[J].现代食品科技，2013，29（4）：932-935，862.

[5]李彦辉，石尔庚.种曲生产的关键点控制[J].中国调味品，2010，35（7）：84-85.

[6]杜双奎，于修烛，李志西，等.酱油种曲培养研究[J].中国酿造，2005，24（12）：12-14.

[7]杨爱华，董广文.细化种曲生产管理[J].中国调味品，2001，26（11）：24-26.

[8]MA Y Y,ZHAO Z K,PAN X H,et al.Primary study on optimization of the processing technology inAspergillus oryzaeseed koji by homogeneous design[C]//Advanced Materials Research.Switzerland:Trans Tech Publications,2013:1071-1074.

[9]胡晓刚，马 莺，何胜华，等.米曲霉Y29 制曲条件研究[J].食品科技，2007（7）：38-42.

[10]吴海滨.利用米曲霉发酵鳕鱼皮制备生物活性肽的研究[D].青岛：中国海洋大学硕士论文，2011.

[11]高永强，边佳娜.黄酒米曲霉菌种的培养研究[J].江苏食品与发酵，2008（3）：33-34.

[12]李云雁，胡传荣.试验设计与数据处理[M].北京：化学工业出版社，2008.

[13]赵飞龙，徐亚平.米曲霉的应用研究进展[J].中国酿造，2006，25（3）：8-10.

[14]徐向宏，何明珠.实验设计与Design—Expect、SPSS 应用[M].北京：科学出版社，2010.

[15]时立文.SPSS 19.0 统计分析从入门到精通[M].北京：清华大学出版社，2012.