正交试验优选补脑软胶囊水提乙醇沉降制备工艺

李喜香, 毕映燕, 李季文, 刘效栓, 潘从泽, 牟倩倩

（甘肃省中医院药剂科, 甘肃 兰州 730050）

正交试验优选补脑软胶囊水提乙醇沉降制备工艺

李喜香*, 毕映燕, 李季文, 刘效栓, 潘从泽, 牟倩倩

（甘肃省中医院药剂科, 甘肃 兰州 730050）

目的 优选补脑软胶囊最佳水提乙醇沉降工艺。方法 以干膏率、阿魏酸、芍药苷的量为评价指标，选取提取时间、料液比和提取次数为考察因素，采用正交试验优选补脑软胶囊的最佳水提工艺;选取浓缩液相对密度、醇沉时间、乙醇体积分数为考察因素，采用正交试验优选补脑软胶囊提取液的乙醇沉降工艺。结果 优选的最佳提取工艺为加 12 倍量的水煎煮 3 次， 每次 1.5 h， 最佳醇沉工艺为浓缩液密度 1.15 g/mL， 乙醇体积分数为 55%， 静置 12 h。 结论 该工艺稳定可行，可作为补脑软胶囊工业化的提取工艺。

补脑软胶囊;水提醇沉;正交试验;阿魏酸;芍药苷

补脑膏为甘肃省中医院自制制剂，在古方佛手散的基础上，重用甘肃道地药材岷当归，配伍川芎、赤芍、黄芪、仙茅、淫羊藿、龟甲、甘草等中药而成，具有益智醒脑、滋肾补髓之效［1］。 在治疗脑炎， 脑膜炎后遗症、 治疗血管性痴呆［2-4］等方面具有较好的临床疗效。 补脑膏过去一直以膏滋应用于临床，储存、运输、服用不便，为了方便该制剂在临床上的使用，减少患者服药剂量，增加患者顺应性，将其制成软胶囊。根据处方中药物所含成分的理化性质及药理效应，采用正交试验法，对补脑软胶囊的水提乙醇沉降工艺进行优化，为工业化生产提供技术支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪 （ 美国 Waters公司 1525 型），717 自动进样器， 2487 双通道紫外检测器， breeze数据处理系统;METTLER AE240 型万分之一电子分析天平 （德国Sartorius公司） ， 十 万 分 之 一 分 析 天 平;HS6150 型 数 控 超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）;ZXFD-A5140 电热鼓风干燥箱。

1.2 试药 当归、 赤芍、 川芎等 14 味药材均购于甘肃省中医院，经甘肃中医学院李成义教授鉴定为正品;阿魏酸（批号 110773-200611， 中国药品生物制品检定所）; 芍药苷（批号 110736-200629， 中国药品生物制品检定所）。 乙腈（山东禹王集团化工分公司生产， 色谱纯）， 甲醇 （天津百世化工有限公司， 分析纯）， 其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计

2.1.1 水提取工艺正交试验 补脑软胶囊有效部位主要为水溶性部分，故以水为溶媒。根据预试验结果，提取次数、料液比、提取时间这三个因素对提取结果影响较大，故对三个因素进行优化， 每个因素设 3 个水平， 采用 L9（34） 正交表安排试验，以干膏率、芍药苷、阿魏酸为评价指标对其最佳提取工艺进行考察， 正交设计因素水平见表1。

表1 水提工艺正交试验

2.1.2 醇沉工艺正交试验设计 乙醇沉降工艺主要受到浓缩液相对密度、乙醇体积分数、醇沉时间的影响，故对三个因素进行优化， 每个因素设 3 个水平， 采用 L9（34） 正交表安排试验，以干膏率、芍药苷、阿魏酸转移率为评价指标对其最佳醇沉工艺进行考察，分别按处方比例称取各药材9份，按水提最佳工艺进行提取，按醇沉正交试验安排表进行试验，按干膏率、芍药苷、阿魏酸量的测定方法测定。 正交试验设计因素水平见表2。

表2 醇沉正交试验

2.2 干 膏率测定 按正交 试 验 所得的提 取 液 浓缩至100 mL， 精密吸取 10 mL， 置干燥至恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干， 残渣于 105 ℃干燥至恒定质量， 取出， 迅速至干燥器中冷却至室温，称定质量，测定所得干膏率。

2.3 定量测定

2.3.1 色 谱 条 件 Waters C18柱 （ 250 mm ×4.6 mm，5 μm）， 以乙腈-0.1%磷酸 （18 ∶82） 为流动相， 体积流量为 1 mL/min， 检测波长为 230 nm， 柱温为室温， 进样量10 μL。 理论塔板数均不低于 4 000。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称定对照品芍药苷、 阿魏酸适量， 加甲醇溶解， 定容于 10 mL量瓶中， 制成质量浓度分别为 1.224、 0.234 mg/mL的对照品溶液， 备用。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密量取各处方下提取液5mL， 水浴蒸干， 加 甲醇 25mL， 称 定 质 量， 超 声 处 理40min， 称定质量， 补足减失质量， 用 0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

2.3.4 阴性样品制备 按照补脑软胶囊的处方制备不含当归、赤芍、 川穹的样品， 按 “2.3.3” 项下方法制成阴性样品溶液。

2.3.5 专属性试验 取 “2.3.2” 项下的对照品 “2.3.3” 项供试品、 “2.3.4” 项下阴性样品溶液各10 μL， 按 “2.3.1” 项下的色谱条件进行测定，芍药苷、阿魏酸和供试品中其他组分色谱峰可达到良好分离，阴性样品溶液对三者的测定无干扰，见图1。

图1 芍药苷、 阿魏酸高效液相色谱图

2.3.6 线性关系考察 精密吸取已配制好的 2 种有效成分标样贮备液适量， 加甲醇制成每 1 mL含芍药苷 0.030 6、0.076 5、 0.153 0、 0.306 0、 0.459 0、 0.612 0mg， 阿魏酸0.004 7、 0.011 7、 0.023 4、 0.046 8、 0.070 2、 0.093 6mg标样溶液， 10 μL进样， 每个质量浓度进样 3 次， 按“2.2.1” 项色谱条件测定， 以峰面积 （Y） 为纵坐标， 质量浓度 （X） 为横坐标， 绘制标准曲线， 芍药苷回归方程为 Y=2 ×107X-18 304 （r=0.999 9）; 阿魏酸回归方程为Y=3 ×107X+12 231 （r=0.999 9）， 芍药苷、 阿魏酸在选定的质量浓度范围内，线性关系良好。

2.3.7 精密度试验 精密吸取一定质量浓度的对照品溶液10 μL， 连续进样 6 次， 记录峰面积， 芍药苷、 阿魏酸 RSD分别为 0.5%、 0.7%。

精密吸取一定质量浓度的对照品溶液 10 μL， 连续 3日内每日进样2 次， 记录峰面积， 芍药苷、 阿魏酸 RSD分别为 1.3%、 0.9%。

2.3.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液分别在 0、4、 8、 12、 18、 24 h 进样10 μL， 记录峰面积， 芍药苷、 阿魏酸 RSD分别为 1.0%、 1.9%。

2.3.9 重复性试验 精密吸取同一供试品溶液 6 份， 按“2.3.3” 项下样品处理方法处理， 进样 10 μL， 记录峰面积。供试品中芍药苷、 阿魏酸 RSD分别为1.2%、 1.7%。

2.3.10 加样回收率 精密吸取已知含有量的提取液 2.5 mL， 分别加入等量的对照品， 按 “2.3.3” 项下样品处理方法处理， 按 “2.3.1” 项下色谱条件进行测定， 芍药苷、阿魏酸的平均加样回收率分别为 100.3%、 98.45%， RSD分别为 2.4%、 1.2%。

2.3.11 样品测定 精密吸取正交试验安排表下各样品适量， 按 “2.3.3” 项下样品处理方法处理后， 用 0.45 μm微孔滤膜过滤， 取续滤液 10 μL， 进样分析， 按外标法计算样品中芍药苷、阿魏酸的量。

2.4 正交试验结果与分析

2.4.1 水提取工艺正交试验结果 采用综合评分法进行分析， 用 L9（34） 正交表进行试验优选， 对所得的结果进行直观分析和方差分析， 结果见表3、 表4。

表3 水提取工艺正交试验直观分析

表4 水提取工艺方差分析

对干膏率、阿魏酸、芍药苷的量进行综合评分，由极差分析可知， 各因素对提取工艺的影响顺序为A＞B＞C， 即提取次数＞加水量 ＞提取时间; 数值直观分析表明 A3＞A2＞ A1， B3＞B2＞B1， C2＞C1＞C3， 选取的提取方式为 A3B3C2。方差分析结果表明，B因素对提取工艺具有显著性影响，故选择 B3。 A因素对提取工艺的影响大于 C因素， 考虑 A、 C因素对工艺影响甚小，但从不影响干膏率及有效成分的量方面综合考察， 选择的最佳工艺为加12倍量的水， 提取3 次，每次 1.5 h， 作为补脑膏软胶囊最佳提取工艺。

2.4.2 醇沉工艺正交试验结果 采用综合评分法进行分析， 用 L9（34） 正交表进行试验优选， 对所得的结果进行直观分析和方差分析， 结果见表5、 表6。

表5 醇沉正交试验直观分析

表6 醇沉试验方差分析

对干膏率、阿魏酸、芍药苷转移率进行综合评分，由极差分析可知，各因素对提取工艺的影响顺序为A＞B＞C， 即浓缩液相对密度 ＞乙醇体积分数 ＞醇沉时间; 数值直观分析表明 A3＞A2＞A1， B2＞B3＞B1， C3＞C1＞C2， 选取的提取方式为 A3B2C3。 方差分析结果表明， A、 B因素对提取工艺具有显著性影响， 故选择 A3B2。 C因素对提取工艺的影响无显著性差异， 为了提高生产效率， 选择 C1，因此选择的最佳工艺为 A3B2C1， 将提取液浓缩至 1.15 g/ mL， 加入一定量乙醇使其醇体积分数达到 55%， 静置 12 h， 作为补脑软胶囊最佳醇沉工艺。

2.5 验证试验

2.5.1 水提取工艺验证试验 称取全方药材 3 份 （每份525 g）， 按照正交试验结果所确定的最佳提取工艺提取，按 “2.2” 项下方法测定干膏率、 按 “2.3” 项下测定方法测定提取液中芍药苷、阿魏酸的量。 结果见表7。

表7 水提取工艺验证试验

2.5.2 醇沉工艺验证试验 称取全方药材 3 份 （每份525 g）， 加12 倍量的水， 煎煮提取3 次， 每次1.5 h， 合并滤液， 浓缩至密度 1.15 g/mL， 用 95%乙醇将其乙醇体积分数调整至 55%， 静置 12 h， 分离上清液， 回收至无醇味， 按 “2.2” 项下方法测定干膏率、 按 “2.3” 项下测定方法测定醇沉液中阿魏酸、芍药苷的量，计算其转移率。结果见表8。

表8 醇沉工艺验证试验

3 讨论

补脑软胶囊是在甘肃省中医院院内制剂补脑膏基础上对其进行剂型改进，其中当归、川芎、赤芍为其主药，工艺考察选取干膏率， 当归、 川芎中阿魏酸［5-8］， 赤芍中芍药苷［9］的量作为其评价指标， 并给予干膏率 0.2， 阿魏酸、芍药苷分别 0.4 的权重系数， 进行综合评分， 优选制备工艺。为了保证醇沉时尽量除去杂质，同时减少有效成分的损失，对补脑软胶囊的醇沉工艺进行了研究，考察过程中以一定乙醇体积分数下醇溶物量以及有效成分的转移率作为考察指标，全面评价其精制工艺。通过多指标综合评分选取的提取醇沉工艺重复性好，可操作性强，为其规范化生产提供理论依据。

本研究同时测定阿魏酸与芍药苷的量，达到同时控制处方中三种药材的目的。在检测波长的选择上，同时测定二者含有量的文献已有报道［10-16］， 文献中以 230 nm作为检测波长， 故本实验也在 230 nm处进行测定， 结果二者响应信号良好。阿魏酸为酸性物质，在酸性流动相条件下可完全游离， 分离度较高。 因此选择乙腈-0.1%磷酸系统作为流动相，二者达到良好分离。

［1］ 李妍怡， 窦友义，朱亚萍， 等.补脑膏治疗小儿智力低下85 例［J］.中国中医药信息杂志， 2005， 12（5）:52.

［2］ 李妍怡， 刘志军， 杨瑞龙， 等.补脑膏治疗血管性痴呆70例［J］.中医研究， 2010， 23（1）:41-43.

［3］ 刘力昌，李妍怡，张可兰.补脑膏对血管性认知障碍大鼠认知障碍的改善作用及其机制的研究［J］.中医研究，2006， 19（1）:19-22.

［ 4 ］ 兰美华， 吴红彦.中医治疗老年性痴呆研究进展［J］.实用中医药杂志， 2011， 27（9）:644-646.

［ 5 ］ 胡益勇， 徐晓玉.阿魏酸的化学和药理研究进展［J］.中成药， 2006， 28（2）:253-255.

［6］ 洪燕龙， 徐德生，冯 怡， 等.川芎中含阿魏酸效应组分的提取、 纯化工艺研究［J］.中国中药杂志， 2007， 32（17）:1740-1743.

［7］ 丁明玉， 马帅武，刘德麟.阿魏酸的稳定性及其在川芎和当归药材中的存在形式［J］.中草药， 2004， 35 （1）: 32-34.

［8］ 赵 飞， 胡燕月，陈益萍， 等.川芎中阿魏酸的提取分离［J］.中国医院药学杂志， 2005， 25（1）:11-13.

［ 9 ］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010 年版一部［S］.北京: 中国医药科技出版社， 2010:147-148.

［10］ 李中娥.HPLC法同时测定妇科分清丸中阿魏酸和芍药苷［ J］ .中成药， 2012， 34（3） :487-489.

［11］ 李中娥， 王春颖.HPLC同时测定妇康片中芍药苷和阿魏酸的 含 量 ［ J］.中 国 实 验 方 剂 学， 2012， 18 （10 ）: 143-145.

［12］ 甘井山， 邹爱英， 刘 莹， 等.高效液相色谱法测定接骨片中阿魏酸和芍药苷［J］.现代药物与临床， 2013， 8（3）: 347-349.

［13］ 康博欣， 王冬梅， 王 强， 等.RP-HPLC法同时测定心宁片中芍药苷、 阿魏酸和芦丁的含量［J］.沈阳药科大学学报， 2008， 25（8）:656-659.

［14］ 倪文澎， 钱 平， 周琴妹， 等.HPLC法同时测定养生丸中芍药苷和阿魏酸的含量［ J］.中国药师， 2010， 13 （8）: 1114-1116.

［15］ 孟令丹， 陈晓辉， 姚 燕， 等.RP-HPLC法同时测定四物合剂中芍药苷和阿魏酸的含量［J］.药物分析杂志， 2006，26（10）:1398-1400.

［16］ 马彬峡， 陈恒冲， 吴春高， 等.RP-HPLC法同时测定乐脉颗粒中丹参素、 原儿茶醛、 芍药苷和阿魏酸的含量［J］.药物分析杂志， 2009， 29（7）:1122-1125.

R284.2

:B

1001-1528（2014）12-2625-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.043

2014-04-12

兰州市科技计划项目 （2012-2-78）

李喜香 （1968—）， 女， 主任中药师， 研究方向: 中药制剂工艺。 Tel:15002550389， Email:lixixiang929@163.com