丹皮酚通过抑制 NF-κB信 号 通 路下调 MMP-9 的表达改善心梗后大鼠的心室重构

周晓慧, 赵静怡, 张树峰, 徐 倩

（承德医学院, 河北 承德 067000）

[科研报道]

丹皮酚通过抑制 NF-κB信 号 通 路下调 MMP-9 的表达改善心梗后大鼠的心室重构

周晓慧, 赵静怡, 张树峰, 徐 倩

（承德医学院, 河北 承德 067000）

目的 探讨丹皮酚对大鼠心肌梗死后， NF-κB、 MMP-9 表达的影响。 方法 将结扎左冠状动脉前降支后 24 h 的Wistar大鼠随机分为模型组、 丹皮酚［4、 6、 8 mg/（ kg·d） ］ 组、 卡托普利组及假手术组。 给药 4 周后。 测量各组大鼠心 /体比， 采用 Western-blot法检测各组 大鼠左室后壁心肌组织 NF-κB-P65、 MMP-9 的表 达。 结果 与假 手术组比较， 模型组心/体比明显增加 （P＜0.05）， NF-κB-P65、 MMP-9 的表达显著升高 （P＜0.01， P＜0.05）; 与模型组比较， 丹皮酚 ［4、 6、 8 mg/（kg·d）］ 组、 卡托普利组心/体比明显降低 （P＜0.05）， NF-κB-P65、 MMP-9 的表达显著降低 （P＜0.05）。 结论 心梗后心室重构过程， NF-κB-P65、 MMP-9 的表达增加， 共同参与了心室重构， 丹皮酚通过抑制 NF-κB-P65， 下调 MMP-9， 逆转心梗后的心室重构。

心肌梗死; 心室重构; 丹皮酚;NF-κB;MMP-9

急性 心 肌梗死 （ acute myocardial infarction） 是导致慢性充血性心力衰竭的最主要病因之一，在急性心肌梗死后进展为心力衰竭的过程中，常常发生心室重构，心室重构是导致心力衰竭发生发展的关键，心室重构包括心肌实质性重构和心肌间质重构，心肌实质重构是指心室肥厚，心肌细胞病理性肥大、变性和坏死，心肌间质重构是指成纤维细胞的增生、 纤维化及细胞外基质 （ECM） 胶原网的量和组成的变化。以前认为心肌在重构中扮演主要角色，目前则认为 ECM纤维胶原合成和降解之间动态平衡在心脏重构过程中的作用十分重要。 ECM重缩是心肌梗死后心脏功能的决定因素［1］。 基质金属蛋白酶 （ MMPs） 是一组依赖于 Zn2+的蛋白酶家族， 是 ECM的水解蛋白， 其中 MMP9是 MMPs家族的主要成员之一。 大量的研究证实无论心梗的早期重构， 还是晚期重构， MMP2、 MMP9 都有持续的高水平的表达［2］。

研究表明，丹皮酚具有抗炎、抗氧化、抗血栓及抗动脉粥样硬化等广泛的药理作用，本课题组前期研究还发现丹皮酚可通过抑制 TLR4 信号通路改善心室重构［3］， 本研究旨在探讨丹皮酚在抗心梗后心室重构的过程中对基质金属蛋白酶 （MMP） 活性的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物、 试剂和主要仪器 健康雄性 Wistar大鼠， 体质量 （250 ±20） g， 购自北京阜康生物科技有限公司， 许可证号:SCXK （京） 2009-0004。 丹皮酚注射液， 宁波天真制药有限公司 （10 mg/2 mL， 批号 0110603）， 卡托普利，江苏平光制药有限公司， 25 mg/片， 批号 120102。 兔抗大鼠 NF-κB p65 多克隆抗体; 小鼠抗大鼠 MMP-9 单克隆抗体购自 Santa Cruz公司; 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔和兔抗小鼠 IgG购自北京中杉金侨生物技术有限公司; 增强化学发光 （ enhanced chem iluminescence， ECL） 试剂盒购自 Millipore公司; 其他试剂均为市售的分析纯。 DW3000-B型小动物人工呼吸机， 淮北正华生物科技有限公司;ECG-11D心电图机，惠州科美思医用仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 急性心肌梗死大鼠模型制作 参照文献 ［4］ 方法，8% 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后， 仰卧位固定大鼠，经气管插管连接呼吸机，左胸纵切口，逐层分离，三、四肋间开胸，分离心包，暴露心脏，于左心耳下缘2 mm处使用无菌线完全结扎左冠状动脉前降支，观察大鼠心电图ST段变化， 以 ST段持续抬高并出现室性心律失常， 判断心肌梗死模型成功。假手术组仅在相应部位穿线，不结扎冠状动脉。排除胸腔内气体，逐层关胸，自主呼吸恢复后拔出气管插管， 缝合皮肤， 术后腹腔注射青霉素 20万单位/d， 连续 3 d， 预防感染。

1.2.2 实验分组和给药方法 将术后存活的模型成功动物随机分为模型组、 丹皮酚低剂量组 ［4 mg/（kg·d）， n= 10］、 丹皮酚中剂量组 ［6 mg/（kg·d）， n=10］、 丹皮酚高剂量组 ［8 mg/（ kg·d）， n=10］、 卡托普利组 ［10 mg/（kg·d）， n=10］， 另设假手术组 （n=8）。 术后第 2天开始给药，每日1次，丹皮酚注射液腹腔注射，卡托普利灌胃给药，假手术组和模型组分别给予等量的生理盐水代替丹皮酚注射液腹腔注射，等容积生理盐水代替卡托普利灌胃。每周称定质量调整药量1次，连续给药4周。4周后各组存活动物数分别为模型组7只，丹皮酚低剂量组8只，丹皮酚中剂量组8只，丹皮酚高剂量组9只，卡托普利组8只， 假手术组 8只。

1.2.3 标本采集及处理 4 周后， 各组大鼠称定体质量，然后断颈处死，开胸迅速取出心脏，称心脏质量，计算心质量与体质量的比值 （ 心 /体） 。 可以看到梗死区呈苍白色，非梗死区呈深红色，剪取左室后壁组织，一部 分 标 本 以 10% 甲 醛 固 定， 石 蜡 包 埋， 其 余 部 分-80 ℃保存备用。

1.2.4 心肌组织 HE染色 取上述石蜡标本相应部位的连续切片各3张， 作HE染色， 观察心肌组织结构变化。

1.2.5 Western-blot测定 NF-κB、 MMP9 的表达 取左室后壁心肌组织，制备心肌组织匀浆，提取心肌组织总蛋白，采用 BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量， 取组织蛋白提取上清液进行 SD-PAGE凝胶电泳。 电泳分离后的蛋白转移到PVDF膜上， 加上 5%脱脂奶粉溶液封闭 4 ℃过夜， 依次加入鼠源 的 NF-κB、 MMP9 和 β-actin 抗 体， 4 ℃ 孵 育 过 夜 ，TBST洗涤 3 次， 10 min/次 ， 再 用 相 应 Ⅱ 抗 室 温 孵 育 1 h，化学发光 ECL显色剂显色， X光胶片显影、 定影， 蛋白条带用 Quantity One凝胶 分 析 软 件 进 行 半 定 量 分 析， 以 靶 蛋白条带的吸光度值与 β-actin 蛋白条带吸光度值的比值表示靶蛋白的水平。

2 结果

2.1 各组大鼠心 /体比 模型组心 /体比较假手术组明显升高， 丹皮酚处理组心/体比， 较模型组均有降低， 高剂量组较为明显， 卡托普利组心/体比， 较模型组明显降低。 见表1。

表 1 各组大鼠心/体比 （）

表 1 各组大鼠心/体比 （）

注: 与假手术组比较，*P＜0.05; 与模型组比较，#P＜0.05

组别 动物数/只心质量/ mg体质量/ g（心/体比）/（mg·g-1）8 756.28 ±12.56 256.45 ±13.39 2.95 ±0.049模型组 7 798.35 ±25.24 249.32 ±10.25 3.20 ±0.067*丹皮酚低剂量 8 780.63 ±22.52 255.65 ±9.45 3.05 ±0.089#丹皮酚中剂量 8 768.56 ±19.45 251.35 ±12.23 3.05 ±0.065#丹皮酚高剂量 9 760.79 ±15.56 258.23 ±11.57 2.94 ±0.043#卡托普利 8 762.38 ±20.34 254.67 ±9.98 2.99 ±0.053假手术组#

2.2 HE染色各组大鼠心肌结构变化 假手术组肌丝完整，心肌细胞清晰可见，排列规则、细胞胞质丰富、间隙均匀，模型组部分心肌纤维溶解断裂、胞间组织松散，细胞核大量消失、固缩、碎裂，胞质嗜酸性染色增强，心肌细胞明显肥大，心肌组织坏死严重，表明急性心肌梗死模型建立成功，丹皮酚中、高剂量组心肌细胞排列及肌纤维溶解断裂程度介于假手术组与模型组之间，表明丹皮酚对心室重构有明显抑制作用，丹皮酚高剂量组心肌受损的改善程度与卡托普利组相当， 整体形态较为清晰。 见图1。

图 1 HE染色各组大鼠心肌结构变化 （ ×200）

2.3 Western-blot检测 NF-κB-P65、 MMP9 的蛋 白表达 模型组 NF-κB-P65 的表达明显高于假手术组 （ P＜0.01）， 丹皮酚低、 中、 高剂量组 NF-κB-P65 的表达显著低于模型组（P＜0.05）， 卡托普利组 NF-κB-P65 的表达显著低于模型组（P＜0.05） 见图 2、 表 2; 模型组 MMP9 的表达明显高于假手术组 （P＜0.05）， 丹皮酚中、 高剂量组 MMP9 的表达显著低于模型组 （P＜0.05）， 卡托普利组 MMP9 的表达低于模型组 （P＜0.05） 见图 3、 表 2。

图 2 W estern-blot检测各组大鼠心肌组织 NF-κBp65 的蛋白表达

图 3 W estern-b lot检测各组大鼠心 肌组织MM P-9 的蛋白表达

表 2 W estern-blot检 测 各 组 大 鼠 心 肌 组 织 NF-κBp65、MMP-9 的蛋白表达 （， n=5）

表 2 W estern-blot检 测 各 组 大 鼠 心 肌 组 织 NF-κBp65、MMP-9 的蛋白表达 （， n=5）

注: 与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01; 与模型组比较，#P＜0.05

组别 （ NF-κB/β-actin） （ MMP-9/β-actin）0.763 7 ±0.020 9 1.073 6 ±0.009 1模型组 1.177 9 ±0.042 4** 1.249 5 ±0.039 9*丹皮酚 低剂 量 1.086 6 ±0.027 4# 1.223 5 ±0.025 6丹皮酚 中剂 量 1.007 6 ±0.017 9# 1.150 7 ±0.029 3#丹皮酚 高剂 量 0.839 1 ±0.020 8# 1.094 9 ±0.044 4#卡托普 利 0.774 8 ±0.019 2# 1.112 1 ±0.036 7假手术组#

3 讨论

急性心肌梗死后，心室发生进行性扩张和外形改变，称为梗死后的 “心室重构”， 是急性心肌梗死后发生慢性心力衰竭的主要病理基础。心室重构包括心肌细胞的变化和细胞外基质的变化，心肌细胞外基质的纤维胶原蛋白合成和降解之间的动态失衡在心脏重构过程中的作用十分重要，心梗后这种平衡被打破，引起心肌间质纤维化，限制心肌活动，引起心室顺应性降低和心肌收缩力下降，进一步可发展为心力衰竭。同时胶原沉积还可减慢除极波通过心肌的速度， 使心肌组织电稳定性遭到破坏， 引起心律失常［5］。

MMP是一组 Zn2+依赖的内切蛋白水解酶家族， 参与细胞外基质的降解和胶原合成的调节［6］。 大量的研究证明，在心肌梗死的心室重构期， MMP2、 MMP9 的表达及活性持续性的升高［7］。 目前认为 MMPs可能介入了心肌梗死后心室重缩过程的几个方面， 包括早期 ECM的降解， 新合成的结缔组织的重缩，炎细胞和纤维母细胞的迁移，血管的生成， 促进胶原沉积和纤维化［8］。 本实验中， 各组大鼠实验前体质量无差异，4周后，模型组大鼠心质量较假手术组增加， 其心/体比明显升高， 表明心梗后有心室重构的发生，心/体比增加可能与心肌细胞肥大、 纤维细胞增生、 胶原沉积及心肌细胞间质纤维化相关。蛋白印迹杂交试验进一步显示， 模型组大鼠心肌细胞中 MMP9蛋白水平明显的高于假手术组 （P＜0.05）， 本实验结果与以往的实验研究结果一致， 心梗后心室重构的过程中 MMP9 的活性和表达持续升高。

本实验结果还显示丹皮酚低、中、高剂量处理组的大鼠心质量和心/体比， 较模型组明显降低; 大鼠心肌细胞的MMP9蛋白表达水平明显的低于模型组， 提示丹皮酚可能通过抑制 MMP-9 的表达， 降低了 ECM 的降解， 减少了心肌正常胶原网络的破坏，从而缓解心梗后室壁的变薄及左室扩张的趋势，改善心梗后的心室重构。

NF-κB是一种分布和作用十分广泛的核转录因子， 它能够与特异基因启动子或增强子区域特定序列结合，启动该基因的转录。 正常情况下， NF-κB与 IκB结合组成无活性的异源复合体存在于细胞质中，在细胞外刺激信号的作用下， IκB发生磷酸化， 磷酸化的 IκB再被泛素化后在 26 S蛋白酶作用下， 释放 NF-κB P50/P65 进入细胞核， 与靶基因上的 κB位点结合并导致该处 DNA发生构象变化， 从而启动或增强靶基因转录［9］。 通过对 MMP-9 基因结构分析发现， MMP-9 基因启动子序列-670—-599 为 NF-κB P65 的 结合位点， 当 κB P65 与 之 结 合 将 诱 导 MMP-9 基 因 转 录［10］。肿瘤细胞侵袭试验发现 NF-κB高度激活伴随 MMP-9 的高表达，是细胞外基质降解的主要调控机制。

炎症的激活是引起心室重构的主要因素， NF-κB是促炎症基因表达的枢纽之一。心肌梗死期，局部缺血，氧供应不足，线粒体内电子传递受阻，加之抗氧化酶活性降低，产生并积累大量活性氧 （ROS）， 较强的氧化应激状态激活NF-κB， 进入细胞核， 调控促炎基因的表达， 如白细胞介素-1β （IL-1β）、 肿瘤坏死因子-α （TNF-α）， IL-1β、 TNF-α一方面可以直接激活 MMPs系统， 特别是 MMP-9 和 MMP-2来降解心肌细胞外基质的胶原纤维网，另一方面可以进一步促进 NF-κB的活化， 形成细胞因子激活的正反馈通路和恶性循环［11］。

本实验结果显示， 模型组大鼠心肌细胞 MMP-9 的水平升高与 NF-κB P65 呈正相关， 证明了在心室的胶原重缩中NF-κB参与了 MMP-9 的表达， 这一结果与以往的研究结果一致。本实验结果还显示丹皮酚处理组与卡拖普利处理组大鼠心肌细胞 NF-κB P65 水平与 MMP-9 同步降低， 且具有统计学意义。课题组前期研究结果证明丹皮酚可抑制高脂血清诱导的人脐静脉内皮细胞 NF-κB的活化。

综上所述，心肌梗死后导致心力衰竭的心室重构是一个多因素参与的复杂过程，其中包括神经内分泌的激活、氧化应激反应、慢性炎症等，但殊途同归，最终将通过激活 NF-κB调控 MMP-9 的表达， 从而参与心室重构， 提示只要阻断 NF-κB—MMP9 通路， 将能够逆转心肌梗死后的心室重构。因而证实丹皮酚改善心梗后心室重构作用可能是通过抑制 NF-κB通路下调 MMP-9 的表达而实现的。

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R285.5

:B

1001-1528（2014）12-2599-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.035

2014-02-13

河北省自然科学基金项目 （C2011406009）; 河北省卫生厅项目 （20100137）

周晓慧 （1957—）， 女， 教授， 硕士生导师， 研究方向: 心血管药理学。 E-mail:zxh5055@sina.com