女贞子酒蒸过程中4种裂环环烯醚萜苷类成分的动态变化

姜 秋, 蒋海强, 李慧芬, 张学兰（山东中医药大学药学院, 山东 济南 250355）

[饮片炮制]

女贞子酒蒸过程中4种裂环环烯醚萜苷类成分的动态变化

姜 秋, 蒋海强, 李慧芬, 张学兰*（山东中医药大学药学院, 山东 济南 250355）

目的 探讨女贞子酒蒸过程中4 种裂环环烯醚萜苷类成分的动态变化规律。 方法 采用 HPLC梯度洗脱的方法同时测定女贞子生品及酒蒸不同时间炮制品 （4， 8， 12， 16， 20， 24 h） 中特女贞苷、 橄榄苦苷、 女贞苷 G13、 女贞苷的量。 流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液， 梯度洗脱; 柱温 25 ℃; 检测波长 235 nm; 体积流量 1.0 m L/m in。 结果 特女贞苷、 橄榄苦苷、 女贞苷 G13、 女贞苷依次在 0.035 5 ～1.78 μg、 0.004 12 ～0.206 μg、 0.011 2 ～0.560 μg、0.001 46 ～0.072 8 μg范围内线性关系良好 （r＞0.999 5）， 平均回收率在 97.7% ～100.0%之间。 在 24 h 之内， 随着酒蒸时间的延长，4种苷类成分均呈现逐渐降低的趋势。结论 炮制对女贞子中裂环环烯醚萜苷类成分含有量具有显著影响， 女贞子酒蒸后特女贞苷、 橄榄苦苷、 女贞苷 G13、 女贞苷均产生质变。 研究结果为揭示女贞子的炮制机理提供了实验依据。

女贞子;酒蒸;裂环环烯醚萜苷;动态变化

女贞 子 为 木犀科植 物 女 贞 Ligubtrum lucidum Ait.的干燥成熟果实，具有滋补肝肾、 明目乌发的功效。酒蒸女贞子可增强其滋补肝肾作用，故在临床用药中女贞子多以酒制品入药［1］。 环烯醚萜苷类成分为女贞子的主要活性成分，具有增强免疫、 抗氧化、 抗炎、 降 血 糖、抗癌等作用［2-5］。 目前从女贞子中分离出的环烯醚萜苷类化合物有近30 种， 包括裂环环烯醚萜苷类和环烯醚萜苷类［6］。《中国药典》 2010 年版规定， 女贞子中特女贞苷含有量不得少于 0.70%［7］。 本课题组前期研究表明，女贞子经酒蒸和清蒸后， 特女贞苷量显著降低［8］，但炮制对女贞子中其他环烯醚萜苷类成分的影响未见报道。 本研究采用 HPLC梯度洗脱的方法同时测定女贞子生品及酒蒸不同时间炮制品中4种裂环环烯醚萜苷类成分特女贞苷、 橄榄苦苷、 女贞苷 G13和女贞苷的量，探讨女贞子酒蒸过程中4种苷类成分的动态变化，为揭示女贞子酒蒸增效机理提供科学依据。

1 实验材料

Agilent1200 高效液相色谱仪 （ 美国 Agilent公司）;FA1604N型电子天平 （上海精密科学仪器有限公司）;KQ-250E型医用超声波清洗器 （江苏昆山市超声仪器有限公司）。 特女贞苷、 女贞苷 G13（为本实验室自制， 纯度均大于 98%）; 橄榄苦苷（上海源叶生物科技有限公司， 批号 20121029）;女贞苷 （云南西力生物科技有限公司，批号35897-92-8）; 黄 酒 （ 山 东 即 墨 黄 酒 厂， 批 号20120203， 酒精度 ≥16.5%）; 高 效 液 相用乙腈（色谱纯）， 娃哈哈 纯净水，; 其余试剂均为分析纯。

女贞子药材购自山东百味堂中药饮片有限公司，经山东中医药大学中药鉴定教研室周凤琴教授鉴定为木犀科植物女贞 Ligubtrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。生女贞子:取原药材，除去杂质，洗净， 50℃烘干。 酒蒸女贞子: 取净女贞子共6份， 各 100 g， 分别加黄酒 20 g（加水稀释至40 g）， 置不锈钢饭盒中， 闷润 4 h， 密闭， 置蒸锅中， 隔水蒸制 4、 8、12、16、 20、 24 h， 取出，50℃烘干。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱 （250 mm × 4.6 mm， 5 μm）; 流动相为乙腈 （A） -0.1%甲酸溶液， 线性梯度洗脱 （0 ～22 min， 20% → 31% A）; 柱温 25 ℃; 检测波长 235 nm， 体积流量 1.0 mL/min， 进样量 20 μL。 在该色谱条件下， 女贞子中4种裂环环烯醚萜苷类成分与其他组分分离度良好， 色谱图见图1。

图1 混合对照品 （A） 与女贞子生品 （B） HPLC图谱Fig.1 Ch romatogram s of reference substances（ A） ， raw herbal pieces（ B）

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取特女贞苷、橄榄苦苷、 女贞苷 G13、 女贞苷对照品适量， 分别置于 10 m L、 10 mL、 10 m L、 50 m L量瓶中， 分别加 50%甲醇制成每 1 mL含特女贞苷 0.178 mg、 橄榄苦苷 0.103 mg、 女贞苷 G13 0.140 mg、 女贞苷0.036 4 mg的对照品溶液， 再分别精密吸取特女贞苷对照品溶液 5 mL、 橄榄苦苷对照品溶液 1 m L、女贞苷 G13 对照品溶液 2 mL、女贞苷对照品溶液1 mL， 置同一 10 mL量瓶中， 加 50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取女贞子生品及各炮制品粉末 （过 60 目筛） 各约 0.1 g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入 50%甲醇 40 m L， 密塞，称定质量， 超声提取 30 min， 取出， 放冷， 再称定质量， 用 50%甲醇补足减失的质量， 摇匀， 滤过，取续滤液， 以微孔滤膜 （0.45 μm） 滤过， 作为供试品溶液。

2.4 线性关系考察 精密吸取上述混合对照品溶液 0.04、 0.08、 0.4、 1、 2 m L， 置 2 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件，分别进样 20 μL， 以色谱峰面积 （Y） 为纵坐标， 以进样量 X（μg） 为横坐标， 进行线性回归， 结果各成分在各自进样范围内线性关系良好， 见表1。

表1 4种成分的线性关系Tab.1 Linear relationship of the four secoiridoid glycosides

2.5 精密度试验 精取生女贞子供试品溶液20 μL，按上述色谱条件， 连续进样 6 次， 测定特女贞苷、 橄榄苦苷、女贞苷 G13、女贞苷峰面积，结果 RSD分别为 1.1%、 1.4%、 1.3%、 1.7%。表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精取生女贞子供试品溶液20 μL，分别在0、 2、 4、 8、 12、 24 h 进样测定特女贞苷、 橄榄苦苷、 女贞苷 G13、 女贞苷峰面积，结果 RSD分别为 1.2%、 1.3%、 1.4%、 2.0%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 取生女贞子粉末 （过 60 目筛）6 份， 各约0.1 g， 精密称定， 制备成供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷 G13、女贞苷的量， 结果 6 次测定的 RSD分别为 1.2%、 1.7%、1.5%、 2.1%。 表明该方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验 取已测知含有量的生女贞子粉末 （ 过 60 目筛） 6 份，各约 0.1 g，精密称定， 分别精密加入特女贞苷 1.184 mg/mL、 橄榄苦苷 0.165 mg/mL、 女贞苷 G13 0.510 mg/mL、 女贞苷 0.041mg/mL对照品溶液各 1 mL， 再以 50%甲醇补足至 40 mL， 按 “2.3”项下方法制备供试品溶液， 进样分析， 结果见表2。

2.9 样品测定 分别取女贞子生品及酒蒸不同时间炮制品粉末各约 0.1 g， 精密称定， 依法制备成供试品溶液，精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各 20 μL， 注入液相色谱仪分析测定，按干燥品计算样品中各指标成分， 结果见表3。

表 2 加样回收率实验结果 （n=6）Tab.2 Results of recovery tests（n=6）

表3 4种成分测定结果Tab.3 Determ ination results of four secoiridoid glycosides

3 小结与讨论

3.1 本研究采用 HPLC梯度洗脱的方法同时测定女贞子炮制品中特女贞苷、橄榄苦苷、 女贞苷 G13和女贞苷的量，结果表明，该方法灵敏可靠、重复性好。

3.2 研究结果显示， 女贞子酒蒸后 4 种裂环环烯醚萜苷类成分含有量均显著降低， 且在 24 h内，随着酒蒸时间的延长，均呈逐渐降低的趋势，说明女贞子经酒蒸后特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13、 女贞苷产生质变。

3.3 环烯醚萜苷类成分性质不稳定， 易被水解［9］。 卜文文等报道， 橄榄苦苷经酸、 碱水解后可获得羟基酪醇［10］。 女贞子中裂环环烯醚萜苷类化合物的结构特点是其分子中的环烯醚萜部分大多通过其裂环上的酯键与红景天苷或酪醇或羟基酪醇等苯乙醇类化合物相连。 如特女贞苷、 女贞苷 G13分子中的环烯醚萜部分通过酯键与红景天苷相连，橄榄苦苷、女贞苷分子中环烯醚萜部分分别通过酯键与羟基酪醇和酪醇相连。本课题组前期研究表明，女贞子酒蒸后红景天苷、酪醇、羟基酪醇量均显著增加，特女贞苷在大鼠体内可代谢为红景天苷，据此推测， 酒蒸后特女贞苷、 女贞苷 G13 水解生成红景天苷，橄榄苦苷水解生成羟基酪醇，女贞苷水解生成酪醇。红景天苷、酪醇、羟基酪醇均含有酚羟 基，具有 较 强 的生 物 活 性［11-12］， 女 贞 子酒蒸后补肝肾作用增强分析与环烯醚萜苷类成分水解生成多种酚类化合物有关。

3.4 本实验结果显示， 女贞子中女贞苷 G13 含有量较高， 因此，将女贞苷 G13 的定量测定纳入到女贞子饮片的质量标准中很有必要。

［ 1 ］ 徐 苹， 张学兰.女贞子炮制历史沿革研究［J］.山东中医药大学学报， 2008， 32（3）:263-265.

［2］ 蔡 溱， 石力夫，胡晋红， 等.特女贞甙体外对小鼠脾淋巴细胞转化和自然杀伤细胞活性的影响 ［ J］.第二军医大学学报， 1998， 19（1）:76.

［ 3 ］ Han J， Talorete T P， Yamada P， et al.Anti-proliferative and apoptotic effects of oleuropein and hydroxytyrosol on human breast cancer MCF-7 cells［ J］ .Cytotechnology， 2009， 59（1）:45.

［ 4 ］ Al-Azzawie H F， Alhamdani M S.Hypoglycemic and antioxidanteffect of oleuropein in alloxan-diabetic rabbits［ J］.Life Sciences， 2006， 78（12） :1371.

［5］ 姜 斐， 姚 楠，钱士辉， 等.女贞子中8个化合物对胰岛素抵抗 HepG2 细胞葡萄糖消耗的影响［ J］.海峡药学，2010， 22（1）:164.

［6］ 赵丽丽， 冯毅凡.女贞子中三萜类和环烯醚萜类成分研究进展［J］.广东药学院学报， 2012， 28（1）:107.

［ 7 ］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010 年版一部［S］.北京: 中国医药科技出版社， 2010:43.

［8］ 张学兰，侯 杰，李慧芬，等.炮制对女贞子中特女贞苷含量的影响［J］.中药材， 2009， 32（4）:498-500.

［9］ 吴立军.天然药物化学 ［ M］.北京: 人民卫生出版社，2003:229.

［10］ 卜文文， 刘常金， 田仕夫.盐酸法和 β-葡萄糖苷酶法水解橄榄叶提取物制备羟基酪醇的比较［J］.食品工业科技，2008， 20（2）:8-10.

［11］ 张明发， 沈雅琴.红景天苷及其苷元酪醇的抗炎、 抗肿瘤和免疫调节作用［J］.药物评价研究， 2013， 36（3）:228.

［12］ 刘威振， 张 兴， 陈新建， 等.羟基酪醇药理作用研究进展［J］.广东药学院学报， 2012， 28（6）:685-688.

Contents dynam ic changes of four secoiridoid glycosides under steam ing time spans w ith w ine in Ligubtrum lucidum Ait

JIANG Qiu， JIANG Hai-qiang， LIHui-fen， ZHANG Xue-lan*

（ Shangdong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）

AIM To study the contents dynamic changes of four secoiridoid glycosides from Ligubtrum lucidum Ait affected by different steaming time spans with wine.M ETHODS The contents of specnuezhenide， oleuropein，G13 and ligustroside in Ligubtrum lucidum Aitwere determined by HPLC under Ligubtrum lucidum Ait and processing time span in 4，8， 12， 16，20 and 24 h.Themobile phase ofwater contained acetonitrile（A） and 0.1%formic acid water in gradient program.The column templerature was 25 ℃， and detection wavelength was set at 235 nm.The flow rate was1.0 mL/min.RESULTS Good linear（ r＞0.999 5 ） response ranges of specnuezhenide， oleuropein， G13， ligustroside were 0.035 5 ～1.78 μg，0.004 12 ～0.206 μg， 0.011 2 ～0.560 μg， 0.001 46 ～0.072 8 μg，respectively.Themean recoveries of five compoundswere 97.7% ～100.0%.In 24 h， as steaming time with wine prolong， the contents of four secoiridoid glycosides decreased throughtout the steaming process.CONCLUSION The contents of secoiridoid glycosides from Ligubtrum lucidum Ait changed significantly after processing.In Ligubtrum lucidum Ait， specnuezhenide，oleuropein，G13 and ligustroside were qualitative alteration as steaming with wine.This could provide experimental evidence to elucidate the research of processing Ligubtrum lucidum Ait.

Ligubtrum lucidum Ait;steaming with wine;secoiridoid glycoside;dynamic changes

R283

:A

1001-1528（2014）12-2561-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.026

2013-11-18

国家自然科学基金面上项目 （81373968）; 济南市企业自主创新计划项目 （201201036）

姜 秋 （1988—）， 男 （ 土家族） ， 硕士生， 研究方向: 中 药新药研发 与中药 炮制原理。 Tel:18765880650 ， E-mail:jiangqiu09@163.com

*通信作者: 张学兰 （1963 —） ， 女， 硕士， 教授， 研究方向: 中药新药研发与中药炮制。 Tel:13406062766， E-mail:zhang8832440@ sina.com