清开灵系列制剂的氨基酸色谱指纹图谱

刘潇潇, 周颖仪, 杨立伟, 王 磊

（1.广东省食品药品检验所, 广东 广州 510180； 2.暨南大学药学院, 广东 广州 510632）

清开灵系列制剂的氨基酸色谱指纹图谱

刘潇潇1, 周颖仪1, 杨立伟1, 王 磊2*

（1.广东省食品药品检验所, 广东 广州 510180； 2.暨南大学药学院, 广东 广州 510632）

目的 建立清开灵系列制剂 （注射液、 软胶囊、 胶囊、 颗粒） 的氨基酸色谱指纹图谱。 方法 样品与 2，4-二硝基氟苯衍生化反应， Venusil AA色谱柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm， Agela） ， 以乙腈与 N，N-二甲 基甲酰 胺 -0.025 mol/L醋酸钠 （1 ∶100， 乙酸调 pH6.4） 为流动相， 梯度洗脱， 检测波长 360 nm， 体积流量 1.0 mL/min， 柱温 25 ℃。结果 建立了清开灵注射液、 软胶囊、 胶囊和颗粒等剂型的氨基酸色谱指纹图谱， 并指认了其中 15 个共有峰 （门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、结氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、 组氨酸、 赖氨酸、 苯丙氨酸）， 并对氨基酸类成分的归属进行了探讨。 结论 本研究建立的氨基酸色谱指纹图谱基本能控制清开灵系列制剂中的水牛角、珍珠母及板蓝根的内在质量。

清开灵系列制剂;氨基酸;色谱指纹图谱

清开灵系列制剂，包括注射液、软胶囊、胶囊、颗粒，均为国家基本药物目录品种，由胆酸、猪去氧胆酸、黄芩苷、水牛角、珍珠母、栀子、板蓝根、金银花八味药组成，具有清热解毒，化痰通络，醒神开窍等功效，主要用于急性肝炎、上呼吸道感染、肺炎、脑出血、急性气管炎、高热等病症［1-6］。 清开灵注射 液来源 于安宫牛黄丸组方， 颗粒和胶囊均为注射液的仿制剂型。近年来，临床上关于清开灵注射液引起不良反应的报道时有发生，究其原因之一其现行的质量标准不完善，难以有效控制质量［7-8］。 注射液和胶囊剂 的现行 标准均 收载于 《 中国药典》2010 年版一部［1-2］， 颗粒剂的现行标准收 载 于 部 颁 标 准［4-6］， 其 系 列 标 准 中， 对 胆酸、猪去氧胆酸、黄芩苷、栀子、金银花均有较明确的质控指标。板蓝根、水牛角和珍珠母均含有丰富的氨基酸类成分［9］，三者总氨基酸约占清开灵注射液总固 体的 20%［10-11］， 但 系列 标 准 中， 仅 通过总氮量的测定来控制氨基酸类成分，显然这种方法的准确性和专属性都值得商榷。因此，建立专属性较强的质量评价方法对于水牛角、珍珠母及板蓝根的控制非常必要。本实验利用氨基酸柱前衍生化反应的方 法［12-14］， 建立 了 清 开灵 系 列 制剂 的 氨 基酸类成分指纹图谱，并对7个生产厂家4种剂型84批样品进行了色谱指纹图谱研究分析和比较，同时指认了其中15个共有指纹峰，对其归属也进行了探讨。本研究建立的氨基酸色谱指纹图谱基本能控制清开灵系列制剂中的水牛角、珍珠母及板蓝根的内在质量，以期完善该系列制剂的质量评价体系，也为进一步探讨引起其质量差异的原因奠定基础，以保证该药的质量和临床疗效稳定。

1 实验方法

1.1 仪器与试药 Agilent 1100 系列 （ 包括四元泵、 UV检测器、 柱温箱、 自动进样器、 工作站）; Millipore纯水仪。 乙腈为色谱纯 （ Merck， 德国）;水为纯净水;N，N-二甲基甲酰胺、 醋酸钠、 2，4-二硝基氟苯、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、氢氧化钾均为分析纯。

16 种 氨 基酸对照品即门冬氨 酸 （140691-200401）、 谷 氨 酸 （ 140690-200401 ）、 丝 氨 酸（140688-200401 ）、 甘 氨 酸 （ 140689-200401 ）、 苏氨 酸 （ 140682-200401 ）、 脯 氨 酸 （140677-200405）、 丙 氨 酸 （ 140680-200401 ）、 结 氨 酸（ 140681-200401 ）、 甲 硫 氨 酸 （ 140684-200401 ）、胱氨 酸 （140632-200502 ）、 异 亮 氨 酸 （140683-200401）、 亮 氨 酸 （140687-200401 ）、 色 氨 酸（140686-200401）、 组氨酸 （890-200001）、 赖氨酸（ 140673-200405 ）、 苯 丙 氨 酸 （ 140676-200405 ），均由中国食品药品检定研究院提供。清开灵系列制剂分别来源于国内 7家生产企业， 共 84 批， 其中注射液 44 批、 软胶囊 10 批、 胶囊 16 批、 颗粒14批。

1.2 色 谱 条 件 采 用 Venusil AA （ 250 mm × 4.6 mm， 5 μm） 色谱柱，流动相为乙腈 （A） -N，N-二甲基甲酰胺 -0.025 mol/L醋酸钠 （1 ∶100，乙酸调 pH 6.4） （B）， 梯度洗脱 10%A→43%A→43%A，相应的时间周期为 0→60 min→70 min），检测波长为 360 nm; 体积流量 1.0 mL/min; 柱温25 ℃。 理论塔板数按亮氨酸峰计， 应不低于5 000。

1.3 溶液的制备

1.3.1 混合对照品溶液 分别精密称取 16 种氨基酸对照品适量， 加水制成 1 mg/mL的各单标溶液，再分别精密吸取各单标溶液1 m L于20 m L量瓶中，加水制成每 1 mL分别含各氨基酸 0.05 mg的混合对照品溶液，即得。

1.3.2 注射液供试品溶液 将本品混匀， 即得。

1.3.3 口服制剂供试品溶液 取装量差异项下的本品内容物， 混匀， 胶囊和软胶囊各取约 0.4 g、颗粒剂取约 2.0 g（有糖型）或 1.0 g（无糖型），置具塞锥形瓶中， 精密加水 10 mL， 称定质量， 超声处理 15 min， 加热回流 30 min， 取出， 旋摇使分散，放冷，称定质量，用水补足减失的质量，离心15 min， 取上清液滤过，取续滤液， 即得。

1.4 衍生化反应 分别精密量取对照品溶液与各供试品溶液各 1 mL， 置 25 m L量瓶中， 加入 0.5 mol/L碳酸氢钠溶液 2 mL与 1%2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液 1.5 mL，置 60 ℃水浴中放置 90 min， 取出，放冷， 加磷酸盐缓冲液 （分别取磷酸二氢钾6.8 g与氢氧化钾1.36 g混溶于1 000 m L水中， 用磷酸调 pH为7.0， 即得。）稀释至刻度， 摇匀， 用微孔滤膜滤过，即得。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法、 衍生化反应和色谱条件的优化 注射液为水溶液样品，直接取样进行衍生化反应后测定。根据注射液和各口服制剂的处方，以其供试品溶液1 mL与注射液供试品溶液1 mL中板蓝根、水牛角和珍珠母的处方量基本一致来调整确定胶囊、软胶囊和颗粒的取样量。样品提取过程中，比较了超声、加热回流等方式，结果表明，仅超声或加热回流提取，不能将有效成分完全提出，特别是对于软胶囊样品，方法的重复性较差，故最后采用先超声提取将样品均匀分散于溶液中，再加热回流提取的方法，可完全提出有效成分。根据文献 ［12-14］， 衍 生 化 反 应 在 60 ℃ 水 浴 中 放 置60 min， 本实验考察了反应时间 30、 60、 90 min 和衍生化试剂 1%2，4-二硝基氟苯 （DNFB） 的乙腈溶液的加入量 0.5、 1.0、 1.5、 2.0 mL，试验表明， 反应时间为 60 min 和 90 min 时， 各色谱峰峰面积相当且不再增加。 加入量为 0.5 mL时， 衍生物产率低， 加入量为 2.0 mL时， DNFB副产物 2，4-二硝基苯酚的峰面积太大， 加入量为 1.0 mL和1.5 mL时， 衍生化反应完全且分离效果较理想。故本实验选用 1%DNFB的乙腈溶液的加入量为1.5 mL，反应时间为 90 min。

由于氨基酸的极性不同，考察了不同的梯度洗脱程序，当初始流动相中乙腈的比例较高时，丝氨酸不易分离;当初始流动相中乙腈的比例较低时，甘氨酸和苏氨酸的峰形对称性差，分离度较低。考察了不同的柱温 （22 ℃、25 ℃、28 ℃），柱温较高时，异亮氨酸与亮氨酸不能有效分离。考察了不同 pH （6.2、 6.4、 6.6、 6.8）， pH较低时， 甘氨酸和苏氨酸、 丙氨酸与脯氨酸分离度较低;pH较高时，赖氨酸色谱峰拖尾严重。

2.2 指纹图谱方法学验证 本实验对 7 个生产企业的清开灵系列制剂 84批样品进行了对比测定。经对比确定 15 个峰为各批供试品共有 （色谱峰1 ～15），且峰面积较为稳定，定为共有指纹峰。按 “1.3” 项下供试品溶液的制备和 “1.4” 项下衍生化反应，分别平行配制5份清开灵注射液、软胶囊、 胶囊和颗粒的供试品溶液， 按 “1.2” 项下色谱条件测定，以指纹峰的保留时间和峰面积为指标计算 RSD， 考察方法的重复性; 同一供试品溶液，连续进样5次，以指纹峰的保留时间和峰面积为指标计算 RSD， 考察仪器的精密度; 取供试品溶液， 在 12 h之内不同时间连续进样检测， 以指纹峰的保留时间和峰面积为指标计算 RSD， 考察方法的稳定性。重复性、精密度和稳定性结果见表1。 结果表明，清开灵系列制剂的氨基酸指纹图谱测定方法具有可信的精密度和重复性， 在 12 h内样品稳定，可以获得可靠的指纹图谱。

表1 指纹图谱的方法学验证Tab.1 Evaluation of the fingerprin tm ethod

2.3 专属性考察 精密量取水 1 mL，置 25 mL量瓶中， 按 “1.4” 项下进行衍生化反应， 得空白供试品溶液， 按 “1.2” 项下色谱条件测定。 结果表明， 保留时间 16.8 min 处的色谱峰为 2，4-二硝基苯酚［12］，计算指纹图谱相似度时扣 除该色 谱峰。处方中的其他化学成分、辅料及衍生化试剂对测定均无干扰 （见图 1）。

2.4 色谱峰的指认 通过比较 16 个氨基酸对照品的色谱保留时间，对清开灵系列制剂的氨基酸指纹图谱中的绝大多数色谱峰进行了指认。其中，脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、结氨酸、亮氨酸、门冬氨酸的峰面积较高，与文献 ［9-10］ 报道的清开灵注射液中氨基酸的测定结果较一致，说明使用不同的柱前衍生化试剂 （ 异硫氰酸苯酯［9］、 邻苯二甲醛和9-芴甲基氯甲酸酯［10］） 均能使清开灵注射液中的氨基酸完全衍生化，得到较准确的结果。本实验在此基础上，将柱前衍生化法应用于清开灵系列其他固体制剂，结果表明该法结果准确可靠，可用于清开灵其他制剂的氨基酸指纹图谱的建立和应用。另外，组氨酸 （His）和苯丙氨酸 （Phe） 的保留时间相同。

图1 氨基酸混合对照品溶液 （A）、 清开灵注射液 （B）、清开灵胶囊 （C）、 清开灵颗粒 （D）、 清开灵软胶囊 （E） 和空白溶液 （F） 的 HPLC氨基酸指纹图谱Fig.1 HPLC fingerp rint of am ino acids reference solution（A） ， Qingkailing In jection （ B）， Q ingkailing Capsules（ C） ， Qingkailing Granules（ D） ， Qingkailing Soft Capsules（ E） and b lank solution（ F）

2.5 氨基酸成分归属的探讨 为明确清开灵系列制剂氨基酸指纹图谱中鉴定色谱峰的药材归属，将成品指纹图谱与板蓝根、水牛角、珍珠母中间体的氨基酸色谱图对照，比较色谱峰的保留时间以及DAD的光谱图， 确认了这 15 个氨基酸共有指纹峰的来源和归属，列于表2中。可见，本实验所得清开灵系列制剂的氨基酸指纹图谱的色谱峰成分基本上来自于板蓝板和水牛角水解液。据报道，珍珠母中也有较 丰富 的 氨 基酸 类 成 分［15-16］， 但本 实 验 测定的珍珠母中间体的氨基酸色谱图中色谱峰较少，其原因有待进一步研究。

表2 氨基酸指纹图谱中色谱峰的药材归属Tab.2 Herb classification of the am ino fingerprin t peaks

2.6 不同批号清开灵系列制剂的相似度计算 分别取清开灵注射液 44 批、 软胶囊 10 批、 胶囊 16批、 颗粒14 批， 样品按 “1.3”项下供试品溶液的制备方法和 “1.4” 项下衍生化方法制备， 按“1.2”项下色谱条件测定， 色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统中，按照保留时间进行谱峰匹配后，生成对照指纹图谱，计算各剂型各厂家各批次与其对照指纹图谱的相似度。结果显示，各厂家清开灵注射液、软胶囊、胶囊、颗粒的各批次氨基酸指纹图谱与各剂型对照指纹图谱的相似度值均大于0.90， 其平均值见表3， 说明清开灵系列制剂的 HPLC氨基酸指纹图谱相似度良好， 表明各制剂的稳定性和一致性均良好。

表3 清开灵系列制剂的相似度平均值Tab.3 Average sim ilarity of Qingkailing preparations

2.7 样品色谱数据的系统聚类分析 运用 SPSS 软件，对所得高效液相指纹图谱数据进行聚类分析。将7 个厂家不同剂型 84 批清开灵系列制剂的 15 个共有峰峰面积导入 SPSS 软件，采 用 Ward 法 （Ward's Method）， 利用平方 Euclidean 距离 （Squared Euclidean distance） 作为样品的测度进行分析。 聚类分析将不同厂家不同剂型样品分为4类。注射液和其他固体制剂分为两大类，说明液体制剂和固体制剂的差异较大，与注射液和固体制剂不同的制法相关。注射液中厂家 D和 F分在第 IV类， 厂家 A、 B、C、 E分在第Ⅲ类; 固体制剂中， 厂家 A生产的胶囊和颗粒分在第Ⅰ类，厂家G生产的胶囊和颗粒，以及厂家B生产的软胶囊分在第Ⅱ类，说明不同生产厂家对固体制剂样品的影响优先于不同剂型对其的影响。根据图2聚类分析结果，在剂型基本一致的前提下，不同厂家的清开灵制剂样品存在差异，与不同厂家选用的原料药材来源、生产制备工艺参数等差异有关。

图2 聚类分析Fig.2 Cluster analysis

3 结论

本研究通过柱前衍生化-HPLC/UV法检测氨基酸类成分，建立了清开灵注射液、软胶囊、胶囊和颗粒的氨基酸色谱指纹图谱， 并确认了其中 15个共有指纹峰。 对 7个厂家 84批清开灵系列制剂的氨基酸指纹图谱进行了相似度评价和聚类分析，结果表明各厂家各批次样品的指纹图谱相似度较高，质量较稳定，不同厂家的清开灵系列制剂因生产工艺等差异存在一定的质量差异。该方法准确可靠，实现了清开灵系列制剂中氨基酸类成分的有效分离和整体评价，弥补了清开灵系列制剂现行标准中对板蓝根、水牛角和珍珠母质量控制的不足，有利于清开灵系列制剂的全面评价。

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Chromatograhpic fingerprint of am ino acids in the Qingkailing preparations

LIU Xiao-xiao1， ZHOU Ying-yi1， YANG Li-wei1， WANG Lei2*

（1.Cuangdong Institute for Food and Drug Control， Cuangzhou 510180， China;2.Collegeof Pharmacy， Jinan University， Cuangzhou 510632， China）

AIM To establish a chromatograhpic fingerprintof amino acids in the Qingkailing preparations， including injections， capsules， soft capsules and granules.METHODS The HPLC analysis of derivatives of preparation with 2，4-dinitro fluorobenzenewas performed on a Venusil AA C18reversed-phase column.Themobile phase consisted of acetonitrile（ phase A） and 0.025mol/L sodium acetate buffer（ pH=6.4）containing 10 mL/L N，N-dimethylformamide（ phase B） in a gradient elution manner.The detection wavelength was set at360 nm.The column temperature was kept at25 ℃ and themobile phase flow rate was1.0 m L/min.RESULTS The amino acids fingerprints of Qingkailing preparations were established and fifteen common peaks were identified as Asp， Glu，Ser，Gly， Thr， Pro， Ala，Val， Met，Cly， Ile， Leu， Try， His/Phe， and Lys.Classification of these amino acids were also attempted.CONCLUSION Themethod can be used to control the quality of BubaliCornu， Margaritifera Concha and Isatidis Radix.

Qingkailing preparations;amino acids;fingerprint

R284.1

:A

1001-1528（2014）12-2537-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.020

2013-12-23

国家自然科学基金青年科学基金资助项目 （81302654）

刘潇潇 （1982—）， 女， 副主任药师， 理学博士， 研究方向: 中药及其制剂分析。 Tel: （ 020） 81886161， E-mail:cpulxx@ 126.com

*通信作者: 王 磊 （1982 —） ， 男， 副研究员， 理学博士， 研究方向: 天然药物化学。 Tel: （020 ） 85223553， E-mail:cpuwanglei@ 126.com